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磷脂酶C( Phospholipases C,PLC )試劑盒說(shuō)明書(shū)

閱讀:649      發(fā)布時(shí)間:2023-05-12
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磷脂酶C Phospholipases C,PLC )試劑盒說(shuō)明書(shū)

 微量法100T/96S

 

    意:正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義:

磷脂酶CEC3.1.4.3)是一種水解甘油磷酸酯C3位點(diǎn)甘油磷酸酯鍵的脂類(lèi)水解酶,廣泛存在于微生物及動(dòng)植物的組織和細(xì)胞中,在細(xì)胞代謝、細(xì)胞傳遞、生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有重要作用。

 

測(cè)定原理:

磷脂酶C催化水解NPPC產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚,在410nm處有特征吸收峰。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、研缽、超速冷凍離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋。

 

試劑組成和配制:

提取液:液體100mL×1瓶,4℃保存。

試劑一:液體102mL×1瓶,4℃保存。

試劑二:液體10mL×1瓶,4℃避光保存。

試劑三:液體8mL×1瓶,4℃保存。

 

酶液提?。?/span>

1.        組織:按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)15~10的比例(建議稱(chēng)取約0.1g,加入1mL提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

2.        細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~10001的比例(建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后4℃,10000g離心5min,取全部上清于4℃、100000g離心30min,棄上清,取沉淀溶于1mL試劑一。

3.        血清:直接測(cè)定。                  

 

測(cè)定操作:

 


空白管

測(cè)定管

樣品(μL


20

試劑一(μL

20


試劑二(μL

100

100

充分混勻,37℃反應(yīng)30min

試劑三(μL

80

80

充分混勻,于微量石英比色皿/96孔板,蒸餾水調(diào)零,測(cè)定410nm處吸光值,分別記為A空白管和A測(cè)定管,△A=A測(cè)定管-A空白管。

 

 

酶活計(jì)算公式

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0191x - 0.0103,R2 = 0.9991

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mg prot=A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷(V×Cpr) ÷T = 17.45×A+0.0103÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/g 鮮重)=A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷(V÷V樣總×W) ÷T

                          = 17.45×A+0.0103÷ W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義:104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/104 cell=A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量) ÷T

                          = 17.45×A+0.0103÷ 細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計(jì)算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mL= A+0.0103÷ 0.0191×V反總÷V÷T

                       = 17.45×A+0.0103

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mLV樣:加入樣本體積,0.02mL;V樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mLW:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,30min

 

 

b.       96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.0095x - 0.0103,R2 = 0.9991

1.按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義:每毫克蛋白每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mg prot=A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷(V×Cpr) ÷T

                           = 35.09×A+0.0103÷ Cpr

2.按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義:每克組織每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/g 鮮重)=A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷(V÷V樣總×W) ÷T

                          = 35.09×A+0.0103÷ W

3.按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義:104個(gè)細(xì)胞每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/104 cell=A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷(V÷V樣總×細(xì)胞數(shù)量) ÷T

                    =35.09×A+0.0103÷ 細(xì)胞數(shù)量

4.按照液體體積計(jì)算

酶活性定義:每毫升血清每分鐘水解NPPC產(chǎn)生1nmol對(duì)硝基苯酚所需的酶量為一個(gè)酶活力單位。

PLC活性(nmol/min/mL= A+0.0103÷ 0.0095×V反總÷V÷T

                    = 35.09×A+0.0103

V反總:反應(yīng)總體積,0.2mL;V樣:加入樣本體積,0.02mLV樣總:加入提取液體積,1mLCpr:樣本蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;T:反應(yīng)時(shí)間,30min

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