原代細(xì)胞分離培養(yǎng)是一項實驗技術(shù)，它涉及從生物體中提取組織或細(xì)胞，并將它們轉(zhuǎn)移到體外環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。這些來源包括各種組織器官、外周血和胚胎等。在培養(yǎng)過程中，原代細(xì)胞的生長速度相對較慢，通常在培養(yǎng)的前10代內(nèi)停止生長。因此，通常將培養(yǎng)的細(xì)胞歸類為原代細(xì)胞培養(yǎng)，這些細(xì)胞包括第1到第10代的細(xì)胞。下面讓我們一起來看看原代細(xì)胞分離的注意事項與常見問題吧！
一、常見問題：
1. 保存血清好的方法是什么？
建議將血清存放在 -5℃ 至 -20℃的溫度范圍內(nèi)。如果存放在4℃，請不要超過一個月。如果無法一次使用完整瓶血清，建議將血清經(jīng)過無菌分裝后存放在適當(dāng)?shù)臏缇萜髦?，然后再放回冷凍?br />
2. 如何解凍血清以保持其最佳培養(yǎng)狀態(tài)？
建議將血清從冷凍箱中取出后，首先放置在2～8℃的冰箱中使其融化，然后在室溫下使其融化。但務(wù)必要注意，在融解過程中必須規(guī)律地?fù)u晃以確保均勻。
3. 血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn)，應(yīng)該如何處理？
血清中出現(xiàn)沉淀物有很多原因，但最常見的是由于血清中脂蛋白的變性所致。此外，血清解凍后血纖維蛋白的存在也可能導(dǎo)致沉淀物的生成。
1. 通過使C57BL/6小鼠頸椎脫臼死亡，然后用適量的酒精噴灑和Buffer滴加的方式，快速分離結(jié)腸。
2. 沿著腸系膜進(jìn)行剪開，利用DMEM培養(yǎng)基清洗結(jié)腸，以去除其中的腸腔內(nèi)容物。
3. 使用無菌剪刀將結(jié)腸組織剪成約1mm³大小的碎片。
4. 使用10 mL 0.1%膠原酶I和3%分散酶II對組織進(jìn)行消化，在37℃的搖床上消化25分鐘。
5. 進(jìn)行吹打混勻，并通過100μm細(xì)胞過濾器過濾，以收集上清液。
6. 采用相差消化法和差速貼壁法去除成纖維細(xì)胞。
7. 加入1 mL培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸浮后接種于含有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
8. 當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶的80-90%時，使用5 g/L胰酶消化液進(jìn)行消化，然后將其接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中。
二、注意事項：
原代細(xì)胞培養(yǎng)具有較高的成本，并對培養(yǎng)條件有嚴(yán)格要求。因此，在培養(yǎng)過程中需要特別注意保持無菌環(huán)境，并盡可能去除目標(biāo)細(xì)胞以外的其他細(xì)胞。
1. 在實驗開始前，必須對所有器械進(jìn)行消毒處理，并進(jìn)行高壓滅菌，液體則需要進(jìn)行無菌過濾處理。
2. 酶消化液必須立即現(xiàn)用現(xiàn)配，以確保其活性。
3. 在實驗過程中，需要充分消化組織以確保檢測到足夠數(shù)量的細(xì)胞。
4. 同時，也要盡可能充分去除成纖維細(xì)胞。
5. 在后續(xù)的培養(yǎng)過程中，必須保持全程無菌操作，以確保培養(yǎng)環(huán)境的純凈性。
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