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胰酶消化步驟以及注意事項(xiàng)

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中，貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)、凍存保種，都離不開胰酶消化，如何將細(xì)胞完好的消化下來，則依賴于對胰酶的優(yōu)先選擇以及操作手法。

01關(guān)于胰酶

胰酶全稱胰蛋白酶（Trypsin），是胰臟中提取的一種絲氨酸蛋白水解酶，主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)（如細(xì)胞外基質(zhì)）水解，改變細(xì)胞間的連接，使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并分離單個(gè)的細(xì)胞。

消化步驟

01去掉培養(yǎng)液，用無菌的PBS、Hanks液或無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次，以去除殘余的血清。

02加入少量胰酶細(xì)胞消化液，略蓋過細(xì)胞即可，根據(jù)胰酶效率差異可以增加或減少用量。在室溫下放置30秒至2分鐘（不同的細(xì)胞的消化時(shí)間也不同）

03肉眼觀察瓶壁由半透明（細(xì)胞單層連接成片，如磨砂玻璃）轉(zhuǎn)為透明、點(diǎn)狀（出現(xiàn)細(xì)小空隙）時(shí)，或看見培養(yǎng)瓶壁呈白茫狀即可。

04此時(shí)吸除胰酶細(xì)胞消化液。加入含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下細(xì)胞，即可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)如果發(fā)現(xiàn)消化不足，則加入胰酶細(xì)胞消化液重新消化。

注意事項(xiàng)

1、如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞消化時(shí)間過長，未及吹打細(xì)胞，細(xì)胞已經(jīng)有部分直接從培養(yǎng)器皿底部脫落（如見大量細(xì)胞片狀脫落，就是消化過頭了），直接用胰酶細(xì)胞培養(yǎng)液把細(xì)胞全部吹打下來。1000-2000g離心1分鐘，

沉淀細(xì)胞，盡量去除胰酶細(xì)胞消化液后，加入含血清的培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞，即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2、影響消化速度的因素較多，主要有胰酶溶液的活性、消化時(shí)的溫度以及所加胰酶量等 。