α-酮shu二酸脫氫酶（α-KGDH）活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

α-酮shu二酸脫氫酶活性測定試劑盒 三羧酸

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

α-KGDH（EC 1.2.4.2）廣泛存在于動物、植物微生物和培養(yǎng)細胞的線粒體中，是三羧酸循環(huán)調控關鍵酶之一，催化α-酮shu二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔mei A。

測定原理：

α-KGDH 催化α-酮shu二酸、NAD⁺ 和輔meiA 生成琥珀酰輔meiA、二氧化碳和 NADH，NADH 在 340 nm有特征吸收峰，以NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH（此步可選做）。

5、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體α-KGDH 活性測定。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調零。

2、樣本測定

在試劑五中加入 18ml 試劑四充分溶解，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；

在試劑六中加入 1ml 蒸餾水，充分溶解待用；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；

在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、10μl 試劑六和 180μl 試劑五，混勻，立即記錄 340nm

處 20s 時的吸光值A1 和 2min20s 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

α-KGDH 活性計算：

按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

α-KGDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

α-KGDH（nmol/min /g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=325×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活力單位。

α-KGDH 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.65×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

b.用 96 孔板測定的計算公式如下

按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活性單位。

α-KGDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活性單位。

α-KGDH 活性（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=650×ΔA÷W

按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活性單位。

α-KGDH 活性（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=1.3×ΔA

V 反總：反應體系總體積，2×10-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時間，2min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

α-酮shu二酸脫氫酶活性測定試劑盒 三羧酸