NADPH-細(xì)胞se素C 還原酶（NCR）試劑盒說(shuō)明書

分光光度法 50 管/48 樣

NADPH-細(xì)胞se素C 還原酶NCR試劑盒P450

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做測(cè)定

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450 酶是一組主要存在于肝臟的同工酶，在外源物質(zhì)代謝中具有重要作用，尤其是藥物和毒物的代謝。NCR 作為P450 酶系的重要一員，催化氧化型 P450 還原再生。

測(cè)定原理：

NCR 催化NADPH 還原氧化型細(xì)胞se素 c 生成還原型細(xì)胞se素 c，還原型細(xì)胞se素 c 在 550nm 處有特征吸收峰；通過(guò)測(cè)定 550nm 吸光度的增加速率，來(lái)計(jì)算 NCR 活性。

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 100ml 蒸餾水充分溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存。臨用前配制，加 2.6 ml 蒸餾水充分溶解，4℃保存。試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前配制，加 550 μl 蒸餾水充分溶解，4℃保存。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1ml 玻璃比色皿和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、除去細(xì)胞核和線粒體等：稱約 0.5g 組織，加入 4℃預(yù)冷的 1 ml 試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心 30min，取上清液，轉(zhuǎn)移到超速離心管中。

2、粗制微粒體：4℃，100 000g，離心 60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟 2 的沉淀中加 1 ml 試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g 離心 30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟 3 的沉淀中加試劑二 0.5 ml，蓋緊后充分震蕩溶解，4℃保存待測(cè)。

測(cè)定操作：

分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 550 nm，蒸餾水調(diào)零。

試劑二在 37℃水浴中預(yù)熱 30min。

空白管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 50μl 蒸餾水、900μl 試劑二、50μl 試劑三和 10μl 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分別記為 A1 和A2，△A 空白管=A2-A1。

測(cè)定管：取 1ml 玻璃比色皿，依次加入 50μl 粗酶液、900μl 試劑二、50μl 試劑三和 10μl 試劑四，迅速混勻后于 550nm 處測(cè)定 2min 內(nèi)吸光值變化，第 10 s 和第 130 s 吸光值分別記為 A3 和A4，△A 測(cè)定管=A4-A3。

注意：空白管只需要做一次。

計(jì)算公式：

(1).按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞se素 C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR 酶活性 (nmol/min/mg prot)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T

= 529×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：37℃中，每克樣品每分鐘催化產(chǎn)生 1nmol 還原型細(xì)胞se素 C 為 1 個(gè)酶活單位。

NCR 酶活性(nmol/min/g 鮮重)= (△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷ε÷d×V 反總÷（W×V 樣÷V 樣總）÷ T

= 265×(△A 測(cè)定管-△A 空白管)÷W

ε：還原型細(xì)胞se素C 摩爾消光系數(shù)，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1010μl=0.00101L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml，需要另外測(cè)定；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，50μl=0.05ml；V 樣總：加入提取液體積，0.5ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng)：

試劑三、試劑四臨用前配制，配好未使用完的 4℃可保存兩天。

NADPH-細(xì)胞se素C 還原酶NCR試劑盒P450