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產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

朊病毒（Prion）又稱朊粒、蛋白質(zhì)侵染因子、毒朊或感染性蛋白質(zhì)，是一類能侵染動(dòng)物并在宿主細(xì)胞內(nèi)無(wú)免疫性疏水蛋白質(zhì)。朊病毒有兩種構(gòu)象:細(xì)胞型（正常型PrPc）和瘙癢型（致病型 PrPSc）。兩者的主要區(qū)別在于空間構(gòu)象上的差異，PrPc 是正常細(xì)胞的一種糖蛋白，僅存在α螺旋，而PrPSc 有多個(gè)β折疊存在，溶解度低， 且對(duì)蛋白酶表現(xiàn)抗性。由此可見朊病毒是空間構(gòu)型改變了的正常蛋白質(zhì)，是正常蛋白質(zhì)變性所致。朊病毒對(duì)人類最大的威脅是可以導(dǎo)致人類和家畜患中樞神經(jīng)系統(tǒng)退化性病變，最終不治而亡。因此檢測(cè) PrP mRNA 具有重要的意義。為此本公司以探針法 qPCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了PrP mRNA 的檢測(cè)試劑盒。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到 100 拷貝/反應(yīng)。

3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據(jù)人 PrP mRNA 高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的 RNA

發(fā)生交叉反應(yīng)。

5.既用于定性檢測(cè)，又用于定量檢測(cè)。定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為 5 個(gè)數(shù)量級(jí)。

6.本產(chǎn)品足夠 50 次 20 μL 體系的探針法 qRT-PCR 反應(yīng)。

7.人朊病毒蛋白mRNA探針法熒光PCR試劑盒只能用于科研。

產(chǎn)品參數(shù)：

產(chǎn)品規(guī)格

50T/盒，可滿足一定規(guī)模的檢測(cè)需求。

檢測(cè)方法

實(shí)時(shí)熒光PCR，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)。

試劑盒成分

探針法 qRT-PCR 緩沖液、探針法 qRT-PCR酶混合液 v2、熒光 PCR 專用模板稀釋液、人朊病毒蛋白mRNA 探針法引物-探針干粉、人朊病毒蛋白mRNA 陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7 拷貝/μL)、使用手冊(cè)。

自備試劑

樣品 RNA。

保存和運(yùn)輸

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 1E1-1E6 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。如果需要RNA 陽(yáng)性樣品，需要另外訂購(gòu)。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 6、5、4、3、2、1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 4 號(hào)管中加入 5 μL 1E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 RNA 的制備

7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)

照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?10 μL 上步所得 4 號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) RNA -提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的核酸-提取試劑。

三、Probe qRT-PCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) RT-PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) RT-PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 RT-PCR 陰性對(duì)照

（用水做模板），1 個(gè)用于 RT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照（直接用第 6 步第 4 號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置

完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成分樣品管

N+2 個(gè)RT-PCR

陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管

（1-6 管）

探針法 qRT-PCR 緩沖液各 10 μL10 μL各 10 μL

探針法 qRT-PCR 酶混合液 v2各 1μL1 μL各 1 μL

人 PrP mRNA qRT-PCR

引物-探針混合液各 3 μL3 μL各 3 μL

N+2 個(gè)待測(cè) RNA 樣本各 6 μL不加不加

超純水不加6 μL不加

第 6 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液

（1-6 號(hào)）

不加

不加各 6 μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3

號(hào)樣到 3 號(hào)

管…）

注：部分（如：伯樂 CFX96）機(jī)型如果兩步法效果不理想可采用三步法：50℃ 10

分鐘， 95℃ 10 分鐘，（94℃ 15 秒、65℃ 15 秒、72℃ 30 秒）循環(huán) 35-45

次，每個(gè)循環(huán)第三步采集熒光信號(hào)。四、數(shù)據(jù)處理

12.如果樣本制備陽(yáng)性對(duì)照或PCR 陽(yáng)性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)

驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照或 PCR 陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說明環(huán)境污染， 則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

13.如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

14.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須沒有讀數(shù)， 或者大于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于 40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 沒有讀數(shù)、大于或等于 40 則均為陰性，如果小于 40 則為陽(yáng)性。

選擇我們的人朊病毒蛋白mRNA探針法熒光PCR試劑盒，就是選擇精準(zhǔn)、高效、可靠的檢測(cè)方案，為您的科研實(shí)驗(yàn)保駕護(hù)航！