elisa原理與技術(shù)
酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測(cè)方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。
一、酶免疫技術(shù)的分類
酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體或抗原為主要試劑的方法，是標(biāo)記免疫技術(shù)的一種。免疫技術(shù)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行的檢測(cè)方法，即應(yīng)用制備好的特異性抗原或抗體作為試劑，以檢測(cè)標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原。它的特點(diǎn)是具有高度的特異性和敏感性。如將抗原或抗體用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進(jìn)行標(biāo)記，則在與標(biāo)本中的相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，可以不必測(cè)定抗原抗體復(fù)合物本身，而測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，通過(guò)標(biāo)記物的放大作用，進(jìn)一步提高了免疫技術(shù)的敏感性。這種標(biāo)記免疫技術(shù)一般分為兩類，一類用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原或抗體的定位;另一類用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的測(cè)定。前者屬于免疫組化技術(shù)（immunohistochemical chnique）范疇，后者則稱為免疫測(cè)定（immunoassay）。
酶免疫測(cè)定根據(jù)抗原抗體反應(yīng)后是否需要分離結(jié)合的與游離的酶標(biāo)記物而分為均相（homogenous）和異相（heterogenous）兩種類型，實(shí)際上所有的標(biāo)記免疫測(cè)定均可分成這兩類。以標(biāo)記抗體檢測(cè)標(biāo)本中的抗原為例，按照簡(jiǎn)單的形式是在試劑抗體過(guò)量的情況下進(jìn)行，其反應(yīng)式如下：
Ab*+ Ag——Ab*Ag+Ab*
Ab*Ag代表結(jié)合的標(biāo)記物， Ab*為游離的標(biāo)記物。如在抗原反應(yīng)后，先把Ab*Ag與Ab* 分離;然后測(cè)定Ab*Ag或Ab*中的標(biāo)記物的量，從而推算出標(biāo)本中的抗原量，這種方法稱為異相法。如在抗原抗體反應(yīng)后Ab*Ag中的標(biāo)記物* 失去其特性，例如酶失去其活力，熒光物質(zhì)不顯熒光，則不需要進(jìn)行Ab*Ag 與Ab*的分離，可以直接測(cè)定游離的Ab* 量，從而推算出標(biāo)本中的Ag含量，這種方法稱為均相法。
在異相法中，抗原和抗體如在液體中反應(yīng)，分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法有許多種。與放射免疫測(cè)定相類似的液相異相酶免疫技測(cè)定，在某些激素等定量測(cè)定中也有應(yīng)用。但常用的酶免疫測(cè)定法為固相酶免疫測(cè)定。其特點(diǎn)是將抗原或抗體制成固相制劑，這樣在與標(biāo)本中抗體或抗原反應(yīng)后，只需經(jīng)過(guò)固相的洗滌，就可以達(dá)到抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)的分離，大大簡(jiǎn)化了操作步驟。這種被稱為EL1SA 的檢測(cè)技術(shù)成為目前臨床檢驗(yàn)中應(yīng)
用較廣的免疫測(cè)定方法。
二、方法類型和操作步驟
ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：① 固相的抗原或抗體，② 酶標(biāo)記的抗原或抗體，③ 酶作用的底物，根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的性狀以及檢測(cè)的條件，可設(shè)計(jì)出各種不
同類型的檢測(cè)方法。
（一）雙抗體夾心法：
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原zui常用的方法，操作步驟如下：
?。?）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
?。?）加受檢標(biāo)本：使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與同相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。
?。?）加酶標(biāo)抗體：使同相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。*洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。
?。?）加底物：酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進(jìn)行該抗原的定性或定量。
根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物，即可雙抗原夾心法測(cè)定標(biāo)本中的抗體。
?。ǘ╇p位點(diǎn)一步法：
在雙抗體夾心法測(cè)定抗原時(shí)，如應(yīng)用針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測(cè)定時(shí)可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點(diǎn)一步法不但簡(jiǎn)化了操作，
縮短了反應(yīng)時(shí)間，如果使用高親和力的單克隆抗體，測(cè)定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測(cè)定抗原的ELISA提高到新水平。
在一步法測(cè)定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hook effect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過(guò)剩的后滯現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測(cè)抗原濃度相當(dāng)高時(shí)，過(guò)量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實(shí)際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時(shí)甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
?。ㄈ╅g接法測(cè)抗體 ：
間接法是檢測(cè)抗體時(shí)zui常用的方法，其原理為利用酶標(biāo)記的抗-抗體檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體。故稱為間接法。操作步驟如下：
?。?）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過(guò)程中被洗去。
（3）加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如： 欲測(cè)人對(duì)某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人lgG抗體。
?。?）加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。
（四）競(jìng)爭(zhēng)法
競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與同相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：
（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。
