實驗步驟    
基 本 方 案 1 免疫復(fù)合物蛋白激酶測定

此方法可用于測定 E R K 、 J N K 和 p38 M A P K 的活性，也可使用針對每個 M A P K
組分的商品化抗體。然而，特定的抗體對各組分內(nèi)特定的亞型會顯示一定的特異性。

材 料

基本方案 2 固相蛋白激酶法檢測 J N K 活性

這種方法于測定 J N K 活 性 ，它依賴于 J N K 與它的靶轉(zhuǎn)錄因子 c-J u n 的 N H 2 末端活化區(qū)結(jié)合的特異性。

材 料

清晰。在真空中 80°C 下利用干膠儀在 Whatman 3M M 濾紙上將其干燥 lh。
9 . 確認(rèn)在每一步試驗中底物蛋白質(zhì)的水平均相同。將凝膠曝 光 在 X 射線膠片上使其顯
影或者利用磷成像儀分析法，對 32P 摻 入 GST-cJun (1-79) 的量進(jìn)行定量。

基本方案 3 SDS-P A G E 后原位檢測 J N K 蛋白激酶活性 [「膠內(nèi)」（IN-G E L )

激酶測定]
該方案改良自 Gotoh 等 1 9 9 0 年報道的方法。由 于 J N K 對 GST-cJmi ( 1 - 7 9 ) 具有
高特異性，所以該方案測定 J N K 活 性 。如 果 在 膠 中 加 入 GST-Elkl (310-428)
或 M B P ，該方案也適用于檢測 E R K 的活性，但 此 時 也 能 檢 測 出 其 他 能 催 化 Elkl 或
M B P 的激酶，在分析結(jié)果時應(yīng)特別注意。

材 料

基本方案 4 利用磷酸化位點特異性抗體檢測 M A P K 的活化

用 Biosource、 Cell Signaling Technology 及 Promega 公司的抗體均可進(jìn)行如下所述
的檢測，本方案將以 Cell Signaling Technology 的磷酸化-S A P K / J N K (Thr-183/Tyr-
1 8 5 ) 抗體為例。這一方法檢測的是 M A P K 的活化作用，因此并非直接測定 M A P K 的
活性。

材 料

輔 助 方 案 制 備 GST-M A P K 底物融合蛋白

GST-Elkl (310-428) 用作 E R K 的 底 物 、 GST-cJim (1-79) 用作 J N K 的底物、
G S T -A T F 2 (1-109) 用作 p38 的底物。

材 料

感受態(tài)的 (B L 21; Novagen)
編碼 G ST -M A P K 底物融合蛋白的質(zhì)粒 DNA (來 自 Roger.Davis@ Umassmed.edu
或 Alan.J.Whitmarsh @ man.ac.uk， 或 類 似 質(zhì) 粒）， 或純化的 cjun 和 ATF