生物試劑銷售中心kasumi-2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

生物試劑銷售中心細(xì)胞庫(kù)提供遺傳變異細(xì)胞系、正常組織來源細(xì)胞系、腫瘤細(xì)胞系、工程細(xì)胞系、干細(xì)胞系，涉及人類，大鼠、小鼠、鳥類、倉(cāng)鼠、魚類、貓類、狗、牛、貂、豬、恒河猴、長(zhǎng)鼻袋鼠等，我們?nèi)娜鉃槟?wù)，提供產(chǎn)品，保障售后服務(wù)，真心把客戶奉為上帝，及時(shí)處理客戶訂單，全程跟蹤貨源，采用誠(chéng)信快遞運(yùn)輸，認(rèn)真解答客戶疑問，對(duì)客戶售后問題，不拖沓，不推卸責(zé)任，認(rèn)真負(fù)責(zé)的態(tài)度。生物試劑銷售中心kasumi-2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

第三節(jié) 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇

為了防止因污染或技術(shù)原因使長(zhǎng)期培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會(huì)出現(xiàn)變異，有時(shí)因寄贈(zèng)、交換和購(gòu)買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個(gè)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)運(yùn)到另一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，*的策略是進(jìn)行低溫保存。這對(duì)于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡(jiǎn)要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點(diǎn)。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在－70℃以下時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以長(zhǎng)期保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。

一、細(xì)胞的凍存：為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。

有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對(duì)于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：

包含10％甘油的*培養(yǎng)基，

包含10％二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，

50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％甘油的新鮮培養(yǎng)基，或

50％ 細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50％含有10％二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。

對(duì)于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：

50％ 細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50％包含有7.5％二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或

包含有7.5％二甲基亞砜和10％細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。生物試劑銷售中心kasumi-2細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、懸浮細(xì)胞

計(jì)數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以大約200～400g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。

以1×10⁷到5×10⁷細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×10⁷到1×10²⁷在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。

分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

2、貼壁細(xì)胞

使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時(shí)盡可能溫和，使對(duì)細(xì)胞的損傷減少到zui小。

在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。

以大約200g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。

以5×10⁶到1×10⁶細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。

分裝進(jìn)凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。

細(xì)胞以1℃/分鐘進(jìn)行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進(jìn)行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。

二、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇:凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，并直接加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對(duì)凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。

1、直接鋪板方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。

直接用*生長(zhǎng)培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1ml凍存細(xì)胞使用10~20ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基。進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×10⁵活細(xì)胞/ml。培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時(shí)，更換新鮮的*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，去除凍存劑。

2、離心方法

取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。

把1到2ml凍存細(xì)胞加入到大約25ml*生長(zhǎng)培養(yǎng)基，輕輕混勻。

以大約80 g離心2到3分鐘。

棄去上清。

在*生長(zhǎng)培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。

細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。

三、細(xì)胞的分化、衰老與死亡

1、細(xì)胞的分化:一個(gè)成年人全身細(xì)胞總數(shù)約1012個(gè)，可以區(qū)分為200多種不同類型的細(xì)胞：形態(tài)結(jié)構(gòu)，代謝，行為，功能等各不相同。追根溯源，這么多種細(xì)胞均來自一個(gè)受精卵細(xì)胞。所以，通常把發(fā)育過程中，細(xì)胞后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過程稱為細(xì)胞分化。細(xì)胞分化發(fā)生在胚胎階段，也發(fā)生在胎兒出生以后，乃至成人階段。例如，人體血細(xì)胞的產(chǎn)生和分化，這個(gè)過程在人的一生中一直持續(xù)著。

由旺盛生長(zhǎng)不斷分裂的細(xì)胞，轉(zhuǎn)入分化，通常從細(xì)胞周期中G1期開始時(shí)一個(gè)確定的點(diǎn)G0點(diǎn)“逃逸”出細(xì)胞周期。旺盛生長(zhǎng)分裂的細(xì)胞和各種分化了的細(xì)胞，它們的基因表達(dá)和代謝活動(dòng)各不相同。

2、細(xì)胞的衰老:體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明：

成纖維細(xì)胞：來自胎兒傳代50次后衰老死亡,來自成人傳代20次后衰老死亡(與具體年齡有關(guān));來自小鼠傳代14--28次后衰老死亡,來自烏龜傳代90--125次后衰老死亡。

細(xì)胞衰老過程中會(huì)發(fā)生一系列的變化，包括：蛋白質(zhì)合成速度降低，已有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，特異蛋白質(zhì)成份出現(xiàn)；同時(shí)，細(xì)胞核，線粒體，膜系統(tǒng)、骨架系統(tǒng)等都有結(jié)構(gòu)、功能的改變。

細(xì)胞衰老原因，尚無定論，出現(xiàn)過好幾種理論與假說，其中得到較廣泛認(rèn)可的是“自由基損傷假說”。

3、細(xì)胞凋亡:細(xì)胞的死亡是個(gè)體存活的正?，F(xiàn)象，常見的細(xì)胞死亡形式有3種：壞死、凋亡和細(xì)胞毒性。多細(xì)胞生物的生命活動(dòng)中，因?yàn)榄h(huán)境因素的突然變化或病原物的入侵，導(dǎo)致一部分細(xì)胞死，稱為細(xì)胞的病理死亡，或細(xì)胞壞死。壞死是細(xì)胞暴露于嚴(yán)重的物理或化學(xué)刺激時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡；細(xì)胞毒性是由細(xì)胞或者化學(xué)物質(zhì)引起的單純的細(xì)胞殺傷事件，不依賴于其它兩種細(xì)胞死亡機(jī)理，如殺傷T細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。

Acc-3細(xì)胞，人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞

A2 細(xì)胞，人腺樣囊性癌細(xì)胞

AM 細(xì)胞，人腺樣囊性癌（高轉(zhuǎn)移）細(xì)胞

HIC細(xì)胞，人小腸癌細(xì)胞

DMS153細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

H128*細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

H358細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

H520細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

H69細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

HS77細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

NCI-H209細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

NCI-H2227細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

NCI-H446細(xì)胞，人小肺癌細(xì)胞

SMC-1細(xì)胞，人胸膜瘤細(xì)胞

143TK 細(xì)胞，人胸腺激酶缺陷性系細(xì)胞

TF-1細(xì)胞，人血液白血病細(xì)胞

FaDu細(xì)胞，人咽鱗癌細(xì)胞

CCL-138 細(xì)胞，人咽頭癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞

Detroit 562細(xì)胞，人咽頭癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞

 VUP 細(xì)胞，人眼脈洛膜惡性黑色素瘤細(xì)胞

OM431細(xì)胞，人眼脈洛膜惡性黑色素瘤細(xì)胞

SP 6.5細(xì)胞，人眼脈洛膜黑色素瘤細(xì)胞

C918細(xì)胞，人眼脈絡(luò)黑色素瘤細(xì)胞

capan-2細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

CFPAC-1細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

MiaCaPa-2細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

PANC-1細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

PATU8988 細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

PC-2細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

SW 1990細(xì)胞，人胰腺癌細(xì)胞

BxPC-3細(xì)胞，人胰腺腺癌細(xì)胞

HPAC細(xì)胞，人胰腺腺泡上皮癌細(xì)胞

HaCaT細(xì)胞，人永生化表皮細(xì)胞

HL-60*細(xì)胞，人原髓白血病細(xì)胞

HL-60細(xì)胞，人早幼粒急性白血病細(xì)胞

CNE1-lmp1細(xì)胞，人轉(zhuǎn)lmp1基因鼻咽癌細(xì)胞

F2-2細(xì)胞，人轉(zhuǎn)基因鼻咽癌系細(xì)胞

AsPC-1細(xì)胞，人轉(zhuǎn)移胰腺腺癌細(xì)胞

C-33 A細(xì)胞，人子宮頸癌細(xì)胞

ME-180細(xì)胞，人子宮頸表皮癌細(xì)胞

MS751細(xì)胞，人子宮頸表皮癌細(xì)胞

SiHa細(xì)胞，人子宮頸鱗癌細(xì)胞

還有一種情況，一部分細(xì)胞的死亡是生物個(gè)體正

常生命活動(dòng)（代謝、生長(zhǎng)、發(fā)育、分化）的一個(gè)必要部分；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種情況下的細(xì)胞死亡，明顯地受遺傳控制，稱為細(xì)胞凋亡。 凋亡（Apoptosis）則是程序性的、正常的細(xì)胞死亡，是機(jī)體清除無用的或者不想要的細(xì)胞的手段。它與細(xì)胞壞死是兩個(gè)截然不同的過程，無論從形態(tài)學(xué)、生物學(xué)還是生化的特征來說，都有明顯的區(qū)別。細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在于生物界。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞增殖、分化和衰老起著互補(bǔ)與平衡的作用，在多細(xì)胞動(dòng)物的發(fā)育、形態(tài)建成與維持中扮演至關(guān)重要的角色。作為細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，凋亡失控的結(jié)果將是可怕的：凋亡不足時(shí)，易發(fā)生癌變、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡過量則可能產(chǎn)生獲得性免疫缺陷綜合征（HIV）、重癥肝炎與退行性神經(jīng)疾病，如老年性癡呆癥（Alzheimer's disease）、帕金森氏癥（Parkinson's disease）。因此研究細(xì)胞凋亡及其機(jī)理具有重要的理論和實(shí)踐意義。

細(xì)胞凋亡與壞死的區(qū)別

壞死 ：

形態(tài)學(xué)特征-膜完整性喪失，胞漿和線粒體膨脹，全細(xì)胞裂解。

生化特征-離子內(nèi)環(huán)境失調(diào)：非能量依賴性的（被動(dòng)過程，在4°C也可以發(fā)生），隨機(jī)消化DNA（電泳顯示為DNA彌散狀態(tài)），Postlytic DNA斷裂。

生理學(xué)特征-影響群組細(xì)胞：由非生理學(xué)因素引起（如補(bǔ)體攻擊、代謝中毒、缺氧等），被巨噬細(xì)胞吞噬，周圍有明顯的炎癥反應(yīng)。

凋亡 ：

形態(tài)學(xué)特征-胞膜出芽，但保持完整，染色體聚集在核膜周邊，胞漿收縮、細(xì)胞核凝集，zui后細(xì)胞分裂為凋亡小體，Bcl-2家族蛋白導(dǎo)致線粒體膜通透性增加。

生化特征--ATP依賴性的（主動(dòng)過程，在4°C不能發(fā)生），以核小體為單位剪切DNA（電泳顯示為DNA ladder），Prelytic DNA 斷裂,線粒體釋放多種因子至胞漿中（細(xì)胞色素c、AIF），Caspases級(jí)聯(lián)活化，膜對(duì)稱性改變（PS外翻）

生理學(xué)特征--只影響單個(gè)細(xì)胞，由生理學(xué)刺激誘導(dǎo)（如生長(zhǎng)因子缺乏、激素環(huán)境改變等），被臨近細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬，無炎癥反應(yīng)。