人膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

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第六節(jié) 無蛋白培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基

一、無蛋白培養(yǎng)基（protein free midium,PFM）：即不含有動物蛋白的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養(yǎng)基又廣泛的應(yīng)用前景，許多利用基因工程技術(shù)重組的蛋白質(zhì)zui終要應(yīng)用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過程就比較復(fù)雜，zui終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定的難度。無蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢而出現(xiàn)的，許多無蛋白培養(yǎng)基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細(xì)胞生長的無蛋白培養(yǎng)基。人膽管癌細(xì)胞

二、限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium,CDM)：是指培養(yǎng)基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。目前已經(jīng)有適合于293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋白培養(yǎng)基就屬于CDM。

MCF-7/ADR細(xì)胞，人耐阿霉素乳腺癌細(xì)胞

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SGC-7901/VCR細(xì)胞，人耐長春新堿胃腺癌細(xì)胞

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HS 683細(xì)胞，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

SHG-44細(xì)胞，人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞

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SF126細(xì)胞，人腦瘤細(xì)胞

SF17細(xì)胞，人腦瘤細(xì)胞

SF763細(xì)胞，人腦瘤細(xì)胞

SF767細(xì)胞，人腦瘤

H4細(xì)胞，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

U-373MG細(xì)胞，人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞

D283 Med細(xì)胞，人腦髓母瘤細(xì)胞

SK-N-SH細(xì)胞，人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞

U-251細(xì)胞，人腦星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞

U-118 MG細(xì)胞，人腦星形膠質(zhì)母瘤細(xì)胞

U-87 MG細(xì)胞，人腦星形膠質(zhì)母瘤細(xì)胞

5637細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞

 CRL-1472細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞

BIU-87細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞

EJ 細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞

EVC304細(xì)胞，人膀胱癌細(xì)胞

SCaBER細(xì)胞，人膀胱鱗癌細(xì)胞

 BIU-87細(xì)胞，人膀胱移行癌細(xì)胞

J82細(xì)胞，人膀胱移行癌細(xì)胞

SW 780細(xì)胞，人膀胱移行癌細(xì)胞

T24細(xì)胞，人膀胱移行癌細(xì)胞

UM-UC-3細(xì)胞，人膀胱移行癌細(xì)胞

RT4細(xì)胞，人膀胱移行乳瘤細(xì)胞

Tera-2細(xì)胞，人胚惡性畸胎瘤細(xì)胞

293AV細(xì)胞，人胚腎-用于病毒包裝細(xì)胞

HTB-67細(xì)胞，人皮膚黑色素瘤細(xì)胞

SK-MEL-1細(xì)胞，人皮膚黑色素瘤細(xì)胞

22RV1細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

9L-B細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

9L-E細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

ALVA細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

C4-2細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

CL1細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

DU 145細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

DU145*細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

gpc-1細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

JCA-1細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

LNcap細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

Lncap clone FGC細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

ME12細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

P69細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

PC-13細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

PC-3細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

PC-3M 細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

VCaP細(xì)胞，人前列腺癌細(xì)胞

PC-3M-2B4細(xì)胞，人前列腺癌低轉(zhuǎn)移株細(xì)胞

PC-3M IE8細(xì)胞，人前列腺癌高轉(zhuǎn)移株細(xì)胞

MuM-2B 細(xì)胞，人侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞

MuM-2C 細(xì)胞，人侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤細(xì)胞

第七節(jié) 其他細(xì)胞培養(yǎng)用液

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，除了培養(yǎng)基外，還經(jīng)常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調(diào)整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由無機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡單的營養(yǎng)。主要用于取材時組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個主要區(qū)別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO₂ 的培養(yǎng)條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO₃，不能用于5%CO₂的環(huán)境，若放入CO₂培養(yǎng)相，溶液將迅速變酸，使用時應(yīng)注意。

配制溶液應(yīng)使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca²⁺、Mg²⁺，應(yīng)當(dāng)首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液：取材進(jìn)行原代培養(yǎng)時常常需要將組織塊消化解離形成細(xì)胞懸液，傳代培養(yǎng)時也需要將貼壁細(xì)胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養(yǎng)用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因?yàn)檫@些物質(zhì)會對胰酶產(chǎn)生抑制作用。胰酶作用及溶解的*pH是8-9，配制胰酶溶液應(yīng)將液體調(diào)至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調(diào)只pH7.5，也可不調(diào)。

使用細(xì)胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細(xì)胞清洗液（100ml細(xì)胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。人膽管癌細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細(xì)胞，它的作用機(jī)制是破壞細(xì)胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細(xì)胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進(jìn)行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應(yīng)加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細(xì)胞原代培養(yǎng)時經(jīng)常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細(xì)胞產(chǎn)生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的*pH為6.5。膠原酶不受Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的抑制，配制時可用PBS。

三、pH調(diào)整液:常用的有HEPES液和NaHCO₃溶液。

1、NaHCO₃溶液：NaHCO₃是培養(yǎng)基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準(zhǔn)確添加，以保證培養(yǎng)基在5%CO₂的環(huán)境下pH達(dá)到設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是封閉式培養(yǎng)，即不與5%CO₂的環(huán)境發(fā)生交換達(dá)到平衡，所使用的培養(yǎng)基就不能按照說明書所要求加入NaHCO₃。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO₃溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基，使之達(dá)到所要求的pH環(huán)境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細(xì)胞無毒性，主要作用是防止培養(yǎng)基pH迅速變動。在開放式培養(yǎng)條件下，觀察細(xì)胞時培養(yǎng)基脫離了5%CO₂的環(huán)境，CO₂ 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進(jìn)行克隆化培養(yǎng)時要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預(yù)防絕大多數(shù)細(xì)菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養(yǎng)基配制。

五、谷氨酰胺補(bǔ)充液:谷氨酰胺在細(xì)胞代謝過程中起重要作用，合成培養(yǎng)基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養(yǎng)液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨(dú)配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養(yǎng)液內(nèi)。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應(yīng)加溫30℃，*溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。使用時，在每100ml培養(yǎng)液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細(xì)胞培養(yǎng)液中L-谷氨酰胺是大部分細(xì)胞培養(yǎng)基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩(wěn)定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發(fā)降解；需要頻繁地補(bǔ)加L-谷氨酰胺。因而在培養(yǎng)操作過程中經(jīng)常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態(tài)的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養(yǎng)基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中穩(wěn)定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨zui少!

二肽谷氨酰胺在細(xì)胞內(nèi)被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產(chǎn)生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細(xì)胞系統(tǒng)中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是*替代物，它無需適應(yīng)；既可用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，也適合于懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)。

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