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第四節(jié) 合成細(xì)胞培養(yǎng)基

合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成、人工設(shè)計(jì)、配制的培養(yǎng)基。它有一定的配方，是一種理想的培養(yǎng)基。目前合成培養(yǎng)基多達(dá)10多余種，有的培養(yǎng)基仍在不斷進(jìn)行改良。早期組織培養(yǎng)是利用天然培養(yǎng)基，目前合成培養(yǎng)基已經(jīng)成為一種標(biāo)準(zhǔn)化的商品，從zui初的基本培養(yǎng)基發(fā)展到無(wú)血清培養(yǎng)基、無(wú)蛋白培養(yǎng)基，并且還在不斷發(fā)展。合成培養(yǎng)基的出現(xiàn)極大的促進(jìn)了組織培養(yǎng)技術(shù)的普及發(fā)展。

一、基本組分 基本培養(yǎng)基包括四大類物質(zhì)：無(wú)機(jī)鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

無(wú)機(jī)鹽：CaCl₂ KCl MgSO₄ NaCl NaHCO₃ NaH₂PO₄。對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細(xì)胞用以合成蛋白質(zhì)的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉(zhuǎn)化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對(duì)細(xì)胞的培養(yǎng)特別重要，能促進(jìn)各種氨基酸進(jìn)入細(xì)胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來(lái)源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨(dú)配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液中。

維生素：是維持細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生物活性物質(zhì)，在細(xì)胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對(duì)細(xì)胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補(bǔ)充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的，對(duì)具有合成膠原能力的細(xì)胞更為重要。

碳水化合物：是細(xì)胞生命的能量來(lái)源，有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，幾乎所有培養(yǎng)基或培養(yǎng)液中都以葡萄糖作為必含的能源物質(zhì)。人T淋巴白血病細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不*氧化的產(chǎn)物。研究表明，體外培養(yǎng)條件下95％的葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔@降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝效率，降低培養(yǎng)基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統(tǒng)活性低而不能將糖酵解產(chǎn)生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細(xì)胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸與NADH反應(yīng)生產(chǎn)乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進(jìn)行。另一個(gè)可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環(huán)的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復(fù)合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導(dǎo)致糖酵解與TCA循環(huán)的失衡。因此體外培養(yǎng)條件下，葡萄糖主要經(jīng)糖酵解降解，產(chǎn)生過(guò)量的乳酸。減少乳酸生產(chǎn)zui常用的方法是限制培養(yǎng)基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過(guò)低可造成細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。該方法需要對(duì)葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產(chǎn)速率以及目的蛋白的表達(dá)量等參數(shù)進(jìn)行綜合考慮方可應(yīng)用。

SUER1153(XR)     HCC-366細(xì)胞，

SUER1154(XR)     HCC38細(xì)胞，

SUER1155(XR)     HCC4006細(xì)胞，

SUER1156(XR)     HCC-44細(xì)胞，

SUER1157(XR)     HCC-56細(xì)胞，

SUER1158(XR)     HCC70細(xì)胞，

SUER1159(XR)     HCC-78細(xì)胞，

SUER1160(XR)     HCC827細(xì)胞，

SUER1161(XR)     HCC-827-GR5細(xì)胞，

SUER1162(XR)     HCC-95細(xì)胞，

SUER1163(XR)     HCT 116細(xì)胞，

SUER1164(XR)     HCT-15細(xì)胞，

SUER1165(XR)     HCT-8細(xì)胞，人T淋巴白血病細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

在目前常用的培養(yǎng)基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的主要能源，其能量代謝通路與體內(nèi)*不同，表現(xiàn)為葡萄糖主要經(jīng)糖酵解途徑為細(xì)胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過(guò)不*氧化途徑，另一小部分通過(guò)*氧化為細(xì)胞供能。因此，適當(dāng)?shù)恼{(diào)整細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，使之能促進(jìn)細(xì)胞的快速生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，同時(shí)減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動(dòng)物細(xì)胞如CHO、BHK和雜交瘤細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)而言，二者的快速利用并非細(xì)胞必需；相反相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細(xì)胞生長(zhǎng)以及產(chǎn)品質(zhì)量。減少這兩種代謝產(chǎn)物的積累，是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產(chǎn)生的。限制培養(yǎng)基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

除了以上與細(xì)胞生長(zhǎng)有關(guān)的物質(zhì)以外，培養(yǎng)基中一般還要加入酚紅（當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

在較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養(yǎng)液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細(xì)胞培養(yǎng)基

(1)MEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(2)DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(3)RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(4)199細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(5)水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基

(6)歐氏平衡鹽

(7)F-10,F-12細(xì)胞培養(yǎng)基系列

(8)其它類型細(xì)胞培養(yǎng)基

三、干粉培養(yǎng)基的配制

配制培養(yǎng)基要注意以下問(wèn)題：

認(rèn)真閱讀說(shuō)明書。說(shuō)明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO₃、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO₃、谷氨酰胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO₃、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基*溶解之后才能添加。

配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。

所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。

配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。

液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它是一種滅菌后保證無(wú)菌的溶液，必要時(shí)可制成無(wú)內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。

配制方法

在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5％的雙蒸水。

在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。

水洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。

加NaHCO₃到培養(yǎng)基中。

用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過(guò)分?jǐn)嚢琛?/p>

通過(guò)緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調(diào)節(jié)pH值，由于pH值在過(guò)濾時(shí)會(huì)上升0.1到0.3，因而調(diào)節(jié)pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過(guò)濾前要保持密封。

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