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做了很久的WB（western blot），走了很多彎路，其實(shí)發(fā)現(xiàn)WB想要做好并不難，總結(jié)了WB實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)遇到的問題，分析了可能的原因及對(duì)應(yīng)的解決方案，希望能成為你實(shí)驗(yàn)成功的基石。
問題1：轉(zhuǎn)膜不充分
(1)膜沒有*均勻濕透
使用100% methanol浸透膜。
(2)靶蛋白分子量小于10 000
選擇小孔徑的膜，縮短轉(zhuǎn)移時(shí)間。
(3)靶蛋白等電點(diǎn)等于或接近轉(zhuǎn)移緩沖液pH值
可嘗試使用其他緩沖液如CAPS緩沖液（pH 10.5)或使用低pH值緩沖液如乙酸緩沖液。
(4)甲醇濃度過高
過高甲醇濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)與SDS分離，從而沉淀在凝膠中，同時(shí)會(huì)使凝膠收縮或變硬，從而抑制高分子量蛋白的轉(zhuǎn)移。降低甲醇濃度或者使用乙醇或異丙醇代替。
(5)轉(zhuǎn)移時(shí)間不夠
對(duì)于厚的膠以及高分子量蛋白需要延長轉(zhuǎn)移時(shí)間。
問題2：背景高
(1)膜沒有*均勻濕透
使用100% methanol浸透膜。
(2)洗膜不充分
增加洗液體積和洗滌次數(shù)。
(3)阻斷不充分
增加封閉液孵育時(shí)間，或者提高溫度。選擇合適的封閉試劑（脫脂奶粉，BSA，酪蛋白等）。
(3)二抗?jié)舛冗^高
降低二抗?jié)舛取?/span>
(4)檢測(cè)過程中膜干燥
保證充分的反應(yīng)液，避免出現(xiàn)干膜現(xiàn)象。
(5)曝光過度
縮短曝光時(shí)間。
(6)抗體與阻斷蛋白有交叉反應(yīng)
檢測(cè)抗體與阻斷蛋白的交叉反應(yīng)性，選擇無交叉反應(yīng)的封閉劑。洗滌液中加入Tween-20可減少交叉反應(yīng)。
問題3：沒有陽性條帶
（1）抗體染色不充分
增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間。
（2）酶失活
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物。
（3）標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低
設(shè)置陽性對(duì)照，如果陽性對(duì)照有結(jié)果，但標(biāo)本沒有則可能是標(biāo)本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低?？煽紤]增加標(biāo)本上樣量解決靶蛋白含量低的原因。
（4）試劑不匹配
一抗與組織種屬，一抗與二抗或/和底物與酶系統(tǒng)之間不匹配。通過設(shè)置內(nèi)參照可以驗(yàn)證二級(jí)檢測(cè)系統(tǒng)的有效性。
（5）一抗失效
選擇在有效期內(nèi)抗體；并選擇現(xiàn)配現(xiàn)用的工作液。
（6）HRP抑制劑
所用溶液和容器中避免含有*。
問題4：有陽性條帶，但條帶比較弱
（1）抗體染色不充分
增加抗體濃度，延長孵育時(shí)間。
（2）酶活性降低
直接將酶和底物進(jìn)行混合，如果不顯色則說明酶失活了。選擇在有效期內(nèi)、有活性的酶聯(lián)物。
（3）標(biāo)本中靶蛋白含量太低
增加標(biāo)本上樣量。
（4）洗膜過度
縮短洗滌時(shí)間。
（5）HRP抑制劑
所用溶液和容器中避免含有*。
（6）抗體活性降低
選擇在有效期內(nèi)的抗體，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長時(shí)間放置。
（7）封閉過度
減少封閉劑的量或縮短時(shí)間；換用不同封閉劑類型。
（8）曝光時(shí)間過短
延長曝光時(shí)間。
（9）HRP抑制劑
所用溶液和容器中避免含有*。
問題5：條帶位置（大小）不對(duì)；或有非特異性條帶
（1）二抗的非特異性結(jié)合
增加一個(gè)對(duì)照：不加一抗，其他操作過程不變，即可驗(yàn)證背景是否由二抗系統(tǒng)來源。選擇其他二抗（特異性更強(qiáng)的，只針對(duì)重鏈的）。
（2）一抗的特異性不夠
使用單克隆或者親和純化的抗體，保證抗體的特異性。
（3）蛋白降解
使用新鮮制備的標(biāo)本，并使用蛋白酶抑制劑。
（4）二聚體或多聚體存在
增加蛋白質(zhì)變性過程及強(qiáng)度。
（5）抗體濃度過高
降低抗體（一抗、二抗）濃度，可以減少非特異性條帶。
（6）蛋白上樣量過大
降低上樣量。
問題6：背景有斑點(diǎn)
（1）封閉劑中有聚集體
使用前過濾封閉試劑。
（2）HRP耦聯(lián)二抗中有聚集體
過濾二抗試劑，去除聚集體。
問題7：膜上出現(xiàn)反像（暗背景上白色帶）
（1）HRP含量過高
降低酶聯(lián)二抗的濃度。
其它方面：
| 問題 | 可能原因 | 建議解決方法 |
| 推薦電壓條件下電泳時(shí)間過長 | 電泳緩沖液過稀 | 配置新鮮緩沖液，使用1X稀釋液 |
| 推薦電壓條件下電流過高，熱量過大 | 電泳緩沖液過稀 | 配置新鮮緩沖液，使用1X稀釋液 |
| 推薦電壓條件下電流過低或無電流 | 接觸不良 | 在電泳錢移除膠盒底部的封條，確認(rèn)緩沖液沒過加樣孔，檢查buffer core上導(dǎo)線鏈接。 |
| 蛋白帶型條狀（streak） | 上樣過量。樣品中鹽濃度過高 | 降低蛋白上樣量，通過透析或凝膠過濾降低樣品中的鹽濃度。 |
| 樣品沉淀 | 加大樣品中的SDS濃度 | |
| 樣品中的污染，如脂類或DNA復(fù)合物 | 離心或過濾樣品以去除特定污染 | |
| 制膠不佳 | 確保灌膠均勻，一次完成 | |
| 條帶模糊 | 蛋白樣品部分變性 | *變形蛋白 |
| 蛋白樣品部分還原 | 確保加入足夠量的DTT或β巰基乙醇 | |
| 電泳時(shí)間過長 | 觀察前面的指示劑材料，掌握恰當(dāng)?shù)碾娪緯r(shí)間 | |
| 啞鈴形條帶或“微笑”條帶 | 上洋體積過大導(dǎo)致不*堆積。 | 使用恰當(dāng)?shù)纳蠘用娣e，如果樣品過稀，使用超濾濃縮。 |
| 電泳過程中電場不均勻 | 如果蛋白濃度已知，上樣時(shí)確保對(duì)稱。 | |
| 分離膠表面不平 | 在制膠時(shí)使分離膠表面水平 | |
| 凝膠過期 | 在的失效期前使用凝膠 |
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