重磅！利用CRISPRi鑒定出細(xì)胞生長所需的499個lncRNA

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類神秘的長200多個核苷酸但不會編碼任何蛋白的分子。如今，在一項新的研究中，研究人員鑒定出499個lncRNA是功能性的，并且在理解這些分子如何發(fā)揮作用方面取得重大進(jìn)展。他們報道，不同于大多數(shù)蛋白編碼基因---它們往往是眾多細(xì)胞系所必需的---的是，針對測試的6種細(xì)胞系，在鑒定出的lncRNA中，將近90%的lncRNA似乎影響僅僅其中的一種細(xì)胞系的強勁生長。相關(guān)研究結(jié)果于2016年12月15日在線發(fā)表在Science期刊上，論文標(biāo)題為“CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells”。

論文共同通信作者、美國加州大學(xué)舊金山分校神經(jīng)科學(xué)家Daniel Lim說，“lncRNA是一類非常神秘的轉(zhuǎn)錄本，在大多數(shù)細(xì)胞中大量地存在。人們并不清楚的是，存在多少數(shù)量的lncRNA，而且哪些lncRNA在基礎(chǔ)生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。我們吃驚地發(fā)現(xiàn)…大多數(shù)lncRNA僅在一種細(xì)胞類型中發(fā)揮功能。”

之前的研究已證實某些lncRNA在細(xì)胞功能、發(fā)育和疾病中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。美國哈佛大學(xué)lncRNA研究專家John Rinn（未參與這項研究）說，“十年多來，我們已知基因組的大部分經(jīng)轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生lncRNA。幾個研究團(tuán)隊已證實幾十種lncRNA確實是細(xì)胞和甚至有機體活力所必需的。”

但是除了這些研究外，人們對lncRNA如何發(fā)揮功能知之甚少。論文共同通信作者、加州大學(xué)舊金山分校細(xì)胞與分子藥理學(xué)教授Jonathan Weissman說，“我們并不知道的是，它們?nèi)绾伟l(fā)揮功能和它們往往在哪些細(xì)胞類型中發(fā)揮功能。我們并沒有對lncRNA的生物學(xué)重要性獲得良好的認(rèn)識，而且我們僅有有限的工具來試圖解決這些問題。”

為此，Lim、Weissman和同事們開發(fā)出一種CRISPR干擾（CRISPR interference, CRISPRi）平臺，這種平臺靶向7種不同的細(xì)胞系---6種轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系和一種人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞---中的16,401個lncRNA位點。通過利用他們的這種經(jīng)過修飾的CRISPR技術(shù)抑制每個候選lncRNA的表達(dá)從而對上千個位點進(jìn)行篩選之后，他們鑒定出499個lncRNA位點是強勁的細(xì)胞生長所需要的，其中89%的位點似乎僅在一種細(xì)胞類型中發(fā)揮功能。

Lim說，“這種技術(shù)的力量真地是由CRISPRi提供的。我們能夠關(guān)閉這些非編碼轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄。”為了讓CRISPRi篩選平穩(wěn)地開展，研究人員也為每個位點構(gòu)建出由10個向?qū)NA（gRNA）組成的文庫，因而共構(gòu)建出大約170,000種gRNA。他們將這種文庫命名為CRiNCL（CRISPRi noncoding library, CRISPRi非編碼文庫）。

研究人員寫道，zui為令人吃驚的是絕大多數(shù)lncRNA基因似乎改變僅一種細(xì)胞類型中的細(xì)胞生長。Weissman說，“不同于經(jīng)常在很多不同的細(xì)胞類型中發(fā)揮至關(guān)重要作用的蛋白編碼基因，這些僅在一種細(xì)胞中發(fā)揮至關(guān)重要作用的lncRNA很少會在其他的細(xì)胞類型中發(fā)揮著重要作用。這提示著lncRNA在給每個細(xì)胞賦予它自己的身份中發(fā)揮著作用。”

Rinn說，“這項研究是在特定的細(xì)胞系中對lncRNA進(jìn)行全基因組篩選。依據(jù)這項研究，我們?nèi)缃衲軌蜃鞒鼋Y(jié)論：大多數(shù)lncRNA在細(xì)胞活力中發(fā)揮著重要作用，正如猜測中的那樣。但是如今，可以這么說，一切還得實踐證明。”

他提醒道，仍不清楚的是這些鑒定出的499個lncRNA位點如何可能影響細(xì)胞生長。Rinn說，“這項研究格外仔細(xì)地控制全基因組篩選存在的多種不足之處。然而，這項研究并不能夠排除是這些lncRNA的轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮重要作用還是zui終的RNA產(chǎn)物才是一種功能性分子。”

Rinn補充道，這些發(fā)現(xiàn)可能zui終對靶向癌癥治療產(chǎn)生影響。他說，“研究人員證實很多l(xiāng)ncRNA位點在細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用。因此，在發(fā)生細(xì)胞增殖的癌癥等疾病中，這些鑒定出的位點可能代表著一種開發(fā)基于RNA的療法的新方法。”