ELISA試劑盒是以免疫學(xué)反響為根底，將抗原、牽9體的特異性反響與酶對底物的催化效果相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。因為抗原、抗體的反響在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，每參加一種試劑孵育后，可經(jīng)過洗刷除掉剩余的游離反響物，然后確保試驗成果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應(yīng)用中，經(jīng)過不一樣的設(shè)計，詳細(xì)的辦法過程可有多種。即:用于檢查抗體的間接法（圖a）、用于檢查抗原的雙抗體夾心法（圖b）以及用于檢查小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。對比常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。
二.操作過程
ELISA試劑盒辦法一用于檢查不知道抗原的雙抗體夾心法：
1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反響孔中加0.1ml，4℃。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗刷緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗刷，下同）。
2.加樣：加必定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反響孔中，置37℃孵育1小時。然后洗刷。（一起做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。
3.加酶標(biāo)抗體：于各反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗刷。
4.加底物液顯色：于各反響孔中參加臨時制造的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5.停止反響：于各反響孔中參加2M硫酸0.05ml。
6.成果斷定：可于白色布景上，直接用肉眼調(diào)查成果：反響孔內(nèi)色彩越深，陽性程度越強，陰性反響為無色或極淺，根據(jù)所呈色彩的深淺，以“+”、“-”號表明。也可測O·D值：在ELISA檢查儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔O·D值，若大于規(guī)則的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。
辦法二用于檢查不知道抗體的間接法：
用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4。次日洗刷3次。加必定稀釋的待檢樣品（不知道抗體）0.1ml于上述已包被之反響孔中,置37℃孵育1小時,洗刷。（一起做空白、陰性及陽性孔對照）于反響孔中，參加新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗刷,zui后一遍用DDW洗刷。其他過程同“雙抗體夾心法”的4、5、6。
三.留意事項
1.正式試驗時，應(yīng)別離以陽性對照與陰性對照操控試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以確保試驗成果的性。有時本底較高，說明有非特異性反響，可采用羊血清、兔血清或BSA等關(guān)閉。
2.在ELISA試劑盒中，進(jìn)行各項試驗條件的挑選是很主要的，其中包含:
（1）固相載體的挑選：很多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等?，F(xiàn)在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運用前均可進(jìn)行挑選：用等量抗原包被，在同一試驗條件下進(jìn)行反響，調(diào)查其顯色反響是否均一性，據(jù)此判明其吸附功能是否杰出。
（2）包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時，請求純度要好,吸附時一般請求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的zui適濃度需進(jìn)行滴定：即用不一樣的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg／ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相一起，調(diào)查陽性標(biāo)本的OD值。挑選OD值zui大而蛋白量zui少的濃度。關(guān)于大都蛋白質(zhì)來說一般為1～10μg／ml。
（3）酶符號抗體作業(yè)濃度的挑選：首先用直接ELISA法進(jìn)行開始效價的滴定（見酶符號抗體部份）。然后再固定其它條件或采納“方陣法”（包被物、待檢樣品的參閱品及酶符號抗體別離為不一樣的稀釋度）在正式試驗體系里地滴定其作業(yè)濃度。
（4）酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選請求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應(yīng)留意防護。有條件者應(yīng)運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現(xiàn)在較為滿足的供氫體。底物效果一段時刻后，應(yīng)參加強酸或強堿以停止反響。一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物運用液必須新鮮制造，尤其是H2O2在臨用前參加。