HL10152.1 v.A

胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑盒產(chǎn)品說明書

主要用途

胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光（Fura-2）檢測試劑是一種旨在通過線粒體鈣離子特異性熒光探針Fura-2-AM，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強度顯著增強，在熒光分光光度儀下測量不同激發(fā)波長下相對熒光峰值的比值，來測定細胞漿總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。其適用于各種活體細胞（動物、人體等）或冰凍切片組織細胞漿鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細胞內(nèi)，鈣離子主要儲存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細胞器中。其中細胞漿鈣離子在調(diào)節(jié)鈣離子通道，維持細胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。細胞漿鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要線粒體、細胞漿分離。Fura-2 AM（acetoxy-methyl ester），一種具有細胞膜通透性，與鈣離子結(jié)合產(chǎn)生熒光的染料，通過其不同激發(fā)波長340nm/380nm產(chǎn)生的熒光信號比（散發(fā)波長510nm）來測定細胞漿內(nèi)鈣離子水平。 

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      40毫升

染色液（Reagent B） 30微升

介導(dǎo)液（Reagent C）     600微升

飽和液（Reagent D）       2毫升

陰性液（Reagent E）       2毫升

裂解液（Reagent F）     200微升

產(chǎn)品說明書  1份

保存方式

保存染色液（Reagent B）和介導(dǎo)液（Reagent C）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

黑色96孔板：用于樣品操作的容器

熒光酶標儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實驗步驟

• 測定準備

• 設(shè)定好熒光酶標儀：激發(fā)波長340nm和380nm，散發(fā)波長510nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升介導(dǎo)液（Reagent C）和1.5微升染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標記為染色工作液，并放在暗室里備用。然后進行下列操作。 

二、熒光酶標儀檢測

• 準備1個黑色96孔板，標記為：細胞樣品孔、空白對照孔（不含細胞）、大對照孔（含細胞）
• 小心抽去細胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 加入100微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 加入100微升飽和液（Reagent D）到大對照孔里
• 加入100微升陰性液（Reagent E）到空白對照孔里
• 分別加入10微升染色工作液到所有孔里
• 輕輕搖動黑色96孔板，混勻
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去細胞樣品孔里的上清液
• 小心加入100微升清理液（Reagent A）到細胞樣品孔里
• 重復(fù)實驗步驟9和10一次
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 加入5微升裂解液（Reagent F）到大對照孔里
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育15分鐘
• 即刻放進熒光酶標儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU）包括樣品RFU340nm、樣品RFU380nm、空白對照孔RFU340nm、空白對照孔RFU380nm、大對照孔RFU340nm、大對照孔RFU380nm
• 計算樣品細胞漿鈣離子濃度

【（樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）－（空白對照孔RFU340nm/空白對照孔RFU380nm）÷（大對照孔RFU340nm/大對照孔RFU380nm－樣品RFU340nm/樣品RFU380nm）】X（空白對照孔RFU380nm/大對照孔RFU380nm） X 140（納摩爾；解離常數(shù)）

三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測

1． 準備1個待測的細胞爬片樣品

• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去樣品上的染色工作液
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長510nm（細胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍色熒光）

四、冰凍切片檢測

• 準備1個待測的冰凍切片
• 小心加上500微升清理液（Reagent A），覆蓋切片樣品表面
• 小心移去樣品上的清理液（Reagent A）
• 移取300微升清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升染色工作液，混勻 
• 小心加上上述含有染色工作液的溶液到切片樣品上，覆蓋樣品表面
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去切片上的染色工作液
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 小心加上500微升新鮮的清理液（Reagent A）
• 放進37℃細胞培養(yǎng)箱里孵育30分鐘
• 小心移去清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進行觀察：激發(fā)波長340至400nm，散發(fā)波長510nm（組織細胞漿鈣離子呈現(xiàn)藍色熒光）

注意事項

• 本產(chǎn)品為20次（顯微鏡）或60次（96孔   板）操作
• 操作時，須戴手套
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 如果細胞內(nèi)酯酶缺失，則建議使用微注射（microinjection）技術(shù)
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測敏感度可達納摩爾級鈣濃度范圍
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標準

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感