一，C57小鼠BMSCs原代培養(yǎng)

    1，實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備好相關(guān)手術(shù)器械，培養(yǎng)器材及相關(guān)試劑PBS平衡緩沖液、10％FBS，IMDM培養(yǎng)基。

    2，脫頸法處死C57小鼠，在75％乙醇中浸泡5min，轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)中，無(wú)菌條件下分離出小鼠的長(zhǎng)骨(股骨和脛骨)，浸泡于PBS溶液中。

3，對(duì)股骨和脛骨進(jìn)行深層次解剖，去除附著的肌肉組織，剪掉長(zhǎng)骨兩端的干骺端，用10％FBS，IMDM培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發(fā)白，收集洗滌液，用移液槍輕輕吹散分離為單個(gè)細(xì)胞。

4，細(xì)胞接種于六孔板中培養(yǎng)，輕微搖勻，使細(xì)胞在孔中均勻分布，放置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)期間不要移動(dòng)六孔板，使BMSCs充分貼壁。

5，培養(yǎng)48h后換液，用預(yù)熱的PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞2次，添加新鮮培養(yǎng)基，之后每隔48h換液1次。原代培養(yǎng)6-7d后細(xì)胞鋪滿80％(圖1)，可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

            圖1：BMSCs原代培養(yǎng)6-7d (武漢云克隆診斷試劑研究所)

二，BMSCs成脂誘導(dǎo)分化

BMSCs鋪皿，細(xì)胞融合達(dá)80％以上后，棄去原培養(yǎng)基，添加成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IMDM中加入10%FBS，10μg/ml胰島素，1μM地塞米松，0.5mMIBMX，0.1mM吲哚美辛)。3d換液1次， 分化12d。

待脂滴形成后進(jìn)行油紅O染色，PBS緩沖液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS緩沖液清洗2次，油紅O染液浸染30min，PBS緩沖液清洗2次，蘇木素染液浸染1min，棄去染液，倒置顯微鏡下觀察拍照。

成脂誘導(dǎo)分化過(guò)程中發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)5d時(shí)，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變圓并大量脫落，部分細(xì)胞中出現(xiàn)細(xì)小脂滴(圖2)。

                        圖2：BMSCs成脂誘導(dǎo)5d

三，BMSCs成骨誘導(dǎo)分化

BMSCs鋪皿，細(xì)胞融合達(dá)80％以上后，棄去原培養(yǎng)基，添加成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(IMDM中加入10%FBS,5μg/ml胰島素，0.1μM地塞米松，0.2mM維生素C和10mM β-甘油磷酸鹽)。3d換液1次，分化15d(圖3)。

待礦化結(jié)節(jié)形成后，進(jìn)行硝酸銀染色。PBS緩沖液清洗3次，10％中性甲醛固定20min，再用PBS緩沖液清洗2次，硝酸銀染液浸染，于陽(yáng)光下曝光30min，PBS緩沖液清洗2次，倒置顯微鏡下觀察拍照，可見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)(圖4)。

圖3：BMSCs成骨誘導(dǎo)分化6d

 圖4：BMSCs成骨誘導(dǎo)形成礦化結(jié)節(jié)