Southern 轉(zhuǎn)印分析

來源：上海源葉生物科技有限公司 2010年11月25日 09:33

在膠體中的DNA 可利用毛細現(xiàn)象的作用將DNA 牽引轉(zhuǎn)印至覆蓋在膠片上的濾膜，經(jīng)烘烤或UV 照射后，可使DNA 固定在膜上，以進行探針的雜合（hybridization）反應(yīng)。

儀器用具：

玻璃缸;玻璃板或吸水海綿;Crosslinker （Stratalinker 1800, Stratagene）

藥品試劑：

10×SSC （1.5 M NaCl; 0.15 M sodium citrate）或20×SSC

變性溶液（1.5 M NaCl; 0.5 N NaOH）

中和溶液（1 M Tris-Cl; 1.5 M NaCl, pH 7.5）

Nylon membrane 尼龍膜

40 Methods in Biotechnology Vol 1

Whatman 3MM 濾紙

吸水紙

方法步驟：

1）電泳的洋菜膠片，浸于0.25 N HCl 中15 min （當DNA 分子量不大時，可省去此步驟）；以無菌水潤洗膠片后，將膠片置于變性溶液中，于室溫緩慢震蕩15 min，更換新的變性溶液后再處理15 min。

2）以無菌水潤洗膠片，再以中和溶液浸泡30 min，其間更換一次。

3）戴手套將尼龍膜剪裁成膠體大小，在角落剪一缺口作記號。另裁剪數(shù)張較膠片稍小的3MM 濾紙。

4）取一玻璃缸，加入10×SSC。將一塊長形玻璃板架在缸上，裁剪一張長形3MM 濾紙，寬度須略大于膠片，將濾紙置于玻璃板上，使濾紙兩端順著玻璃板垂入缸內(nèi)溶液中。加一些10×SSC 于濾紙上使其濕透，并趕掉濾紙與玻璃板間的氣泡。

?? 若有3~5 cm 厚的干凈海綿，則可取代玻璃板?？蓪⒑＞d置于缸中，加入10×SSC，但不可淹過海綿。海綿濕透后，其上放一張比膠片大的3MM 濾紙，要趕掉濾紙與海綿間的氣泡。

5）將處理過的膠片置于濾紙上，趕掉氣泡，小心將尼龍膜蓋在膠片上，不要有氣泡產(chǎn)生。再依序蓋上兩張以10×SSC 浸濕的濾紙及兩張干的濾紙，并以保鮮膜將膠片四周封住。zui后覆蓋一迭吸水紙，上面放一塊玻璃板或塑料板，以重物壓住即可。在室溫下靜置過夜。

6）轉(zhuǎn)印后，小心移去重物、吸水紙、3MM 濾紙等，在尼龍膜相對于樣品槽的位置作記號。將尼龍膜掀開，與膠片接觸面朝上，置于10×SSC中緩慢震蕩5 min，以洗去附著在膜上的洋菜膠。轉(zhuǎn)印后的膠片可再以EtBr 染色，視是否轉(zhuǎn)印*。

7）將尼龍膜置于干凈的濾紙上（與膠片接觸面朝上），移至UV crosslinker中，進行crosslinking 以將DNA 固定在膜上。

8）干燥后的尼龍膜即可進行雜合。若不立即進行雜合，可將尼龍膜夾于兩張濾紙間，置于干燥箱中存放。

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