胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

來源：上海源葉生物科技有限公司 2010年11月25日 09:36

由于RNA聚合酶一般由數(shù)個(gè)次單元組合而成，早先要在試管內(nèi)應(yīng)用RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄活性合成RNA并非易事，但這個(gè)問題在SP6, T3 及T7 等噬菌體的RNA聚合酶陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)以后，情況已*改觀。這主要是因?yàn)檫@類RNA聚合酶由一條多勝肽（polypeptides）所構(gòu)成，其在進(jìn)行轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)所須辨認(rèn)的啟動(dòng)子長度僅20bp左右，而且轉(zhuǎn)錄起始位置非常明確，轉(zhuǎn)錄效能良好，成了目前進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)的*選擇。要進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)，僅需將目標(biāo)基因次選殖（subclone）至帶有SP6, T3 或T7 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄載體，或者運(yùn)用PCR技術(shù)在基因的一端加上SP6, T3 或T7 啟動(dòng)子的序列，即可運(yùn)用對(duì)應(yīng)的RNA聚合酶活性在試管內(nèi)合成正意股或反意股RNA。以質(zhì)體DNA為模版進(jìn)行胞外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)前，應(yīng)先用限制酶自目標(biāo)基因的一端切開，以免轉(zhuǎn)錄反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行至載體的序列（run-on），但在選擇限制酶切位時(shí)應(yīng)避免使用目標(biāo)基因也帶有的切位；限制酶內(nèi)切好的質(zhì)體DNA經(jīng)phenol/chloroform萃取的后，即可用來進(jìn)行。

儀器用具：微量離心機(jī)

藥品試劑： Plasmid DNA 酵解產(chǎn)物pBlueGus/HindIII 及pBlueGus/BamHI；5×Transcription buffer （200 mM Tris-Cl, pH 8.0; 40 mM MgCl2; 10 mM；spermidine-（HCl）3; 125 mM NaCl; Roche）NTPs （含ATP, CTP, GTP 及UTP 各2.5 mM）；RNase 抑制劑RNasin （40 U/μL）；T7 與T3 RNA polymerase （Roche）??；dH2O/DEPC；100 mM DTT （dithiothreitol）；DNase （RNase-free）

Phenol/chloroform/isoamyl alcohol （25:24:1）, 以下簡稱PCI；Chloroform/isoamyl alcohol （24:1）, 以下簡稱CI

方法步驟：

1）取4 支1.5 mL 微量離心管，分別標(biāo)示 #1, #2, #3 與 #4，再依下表依序在#1 與 #2 加入所需各項(xiàng)試劑（單位 μL）：

?? 注意：在逐一加入各項(xiàng)反應(yīng)試劑時(shí)，微量離心管維持于室溫即可，以免在低溫時(shí)，DNA 遇到轉(zhuǎn)錄緩沖液所含spermidine 產(chǎn)生沉淀。進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)時(shí)，請(qǐng)務(wù)必戴手套！

2）以手指頭輕彈離心管壁使混合均勻，離心數(shù)秒后放置于37℃恒溫水槽作用1 h。

3）反應(yīng)結(jié)束時(shí)，自 #1 與 #2 分別取出4 μL反應(yīng)物，放到微量離心管 #3 與 #4中，將 #3 與 #4 存放于 -20℃冷凍柜中。

4）取1 μL DNase 加到 #1 與 #2，混合均勻后放置于37℃作用15 min，以便去除DNA 模版。

5）反應(yīng)結(jié)束后，加入53 μL dH2O/DEPC，以100 μL PCI萃取一次，劇烈震蕩后，離心14,000 rpm 5 min。

6）以微量移液器P200 將上層液移至一新的微量離心管，下層的PCI以100 μLdH2O/DEPC反萃取（back-extraction）一次。

7）以微量移液器P200 將上層液移至步驟6）的新離心管。

8）估計(jì)兩次上層液聚集的后的總體積，并以等體積的CI 萃取一次，劇烈震蕩后，離心14,000 rpm 5 min。

9）以微量移液器P200 將上層液移至一支新的微量離心管，加入0.1 倍體積的3 M NaOAc （pH 5.2）及2.5 倍體積的酒精。

10）混合均勻，并置于 -20℃過夜，以便沉淀RNA。

隔天：

1）自冷凍柜取出微量離心管，以14,000 rpm 于4℃離心10 min。

2）仔細(xì)移去上清液的后，加入0.5 mL 70%酒精。

3）以14,000 rpm 于4℃離心5 min。

4）去除上清液的后，將微量離心管倒置于一張干凈的衛(wèi)生紙上大約30 min，以便風(fēng)干RNA。

5）以10 μL dH2O/DEPC溶解RNA沉淀

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