一：膠回收常見問題及
二：PCR產(chǎn)物回收試劑盒可能出現(xiàn)問題及解決方法
三：質(zhì)粒抽提常見問題解答
四：基因組DNA抽提
五：RNA操作指南
六：Trizol疑難解答
七：PCR疑難解答
八：RT-PCR
九：RACE

 膠回收常見問題及對(duì)策

1. 沒有回收到DNA片段
如在洗脫后，發(fā)現(xiàn)洗脫液中沒有DNA 片段，請(qǐng)檢查是否按瓶身標(biāo)簽，在洗滌液中加入了無水乙醇。
 

2. 提取率低
1） 融膠液為酸性緩沖液，如融膠后，其pH 值升高將影響提取得率。請(qǐng)加入0.1 倍體積的3M 乙酸鉀（pH5.0）。
2） 長時(shí)間使用后沒有更換的電泳緩沖液，其pH 值較高，將影響DNA 的吸附。請(qǐng)更換新的電泳緩沖液后，再進(jìn)行電泳，然后切膠。
3） 回收片斷大小影響回收效率（見下圖）；
4） 在洗脫前，將洗脫液于30～60℃溫浴，可提高提取效率適當(dāng)延長洗脫時(shí)間可增加回收效率。
5） 正確估計(jì)膠大小，確保加入足夠量的Binding Buffer；使膠*融解；
6） 提高Binding Buffer用量可提高小片斷DNA回收效率.對(duì)于<100bp的DNA片斷,可加入6倍體積的Binding Buffer；

3. 吸光度測(cè)量結(jié)果問題
吸光度測(cè)量的是未知樣品與調(diào)零標(biāo)準(zhǔn)之間的相對(duì)吸光度，所以請(qǐng)用與洗脫液體相同的液體，對(duì)測(cè)量樣品進(jìn)行稀釋和調(diào)零。

4.如何計(jì)算提取率
1） 由于回收前樣品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用測(cè)回收前后吸光度的的方法計(jì)算回收率。
2） 可將回收前后DNA 片段一起電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照后，用配套的軟件進(jìn)行電泳條帶灰度對(duì)比。
3） 注意，電泳條件及拍攝條件將對(duì)灰度對(duì)比結(jié)果造成很大影響，請(qǐng)仔細(xì)操作，以減小誤差。

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PCR產(chǎn)物回收試劑盒可能出現(xiàn)問題及解決方法

1. 無DNA

DNA Wash Buffer沒有用無水乙醇稀釋；

2. 低DNA產(chǎn)量

樣品中加入的Binding Buffer的量太少；請(qǐng)按照使用說明加入足夠量的Binding Buffer；若DNA片段長度小于200bp，可加入6倍體積的Binding Buffer；若DNA片段長度大于4kb，則加入3倍體積Binding Buffer后加入1倍體積的雙蒸水。

3. OD值與瓊脂糖凝膠中的DNA產(chǎn)量不相符

從柱子上洗脫下來的痕量雜質(zhì)增加了A260的值；請(qǐng)按照標(biāo)準(zhǔn)步驟操作；另一方面,還取決于瓊脂糖/EB電泳的質(zhì)量.

4.  點(diǎn)樣時(shí)樣品漂出孔外

在洗滌完之后沒有把柱上的乙醇*除去；甩干空柱,然后再進(jìn)行下面的洗脫步驟.

質(zhì)粒抽提常見問題解答

1. 沒有DNA被洗脫出來

沒有用乙醇稀釋W(xué)ash Buffer，按前面指導(dǎo)的方法準(zhǔn)備DNA Wash Buffer

2. DNA產(chǎn)量低

a. 細(xì)胞裂解率低

只使用含有氨芐青霉素的LB或YT培養(yǎng)基.使用基本方案時(shí)，不要使用超過5ml的高拷貝質(zhì)粒培養(yǎng)物.

在加入Solution‖前細(xì)胞沒有充分混勻，可漩渦振蕩懸浮液使之充分混勻.加入Solution‖后，延長孵育時(shí)間可獲得清晰的裂解液.如果Solution‖沒有蓋緊，可能需要重配.可按以下準(zhǔn)備：0.2N NaOH，1%SDS.

b. 細(xì)菌培養(yǎng)物生長過度或不新鮮

不要于37℃培養(yǎng)超過16小時(shí)，分離質(zhì)粒前長時(shí)間存放培養(yǎng)物是不利的.

c. 使用的是低拷貝數(shù)質(zhì)粒

增加培養(yǎng)物的體積至10ml，或使用質(zhì)粒小量提取試劑盒II，培養(yǎng)物體積為25ml.

3. 產(chǎn)量中有大分子量的DNA污染

加入Solution‖后過分混和細(xì)胞裂解液，加入Solution‖后不要猛烈振蕩或搖勻，可輕輕顛倒離心管幾次使充分混勻

4. 光密度與瓊脂糖凝膠上的DNA不符

從柱子洗脫下來的痕量雜質(zhì)使A260升高；確保按操作指南中的步驟7和8洗脫柱子；另外，還依賴于瓊脂糖／溴化乙錠電泳測(cè)定

5. 瓊脂糖凝膠上可見RNA帶

SolutionI沒有加入RNase A

6. 在瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣時(shí)，質(zhì)粒漂出點(diǎn)樣孔

洗脫步驟后，乙醇沒有*從柱子上去除；按標(biāo)準(zhǔn)操作步驟中*甩干spin-column。