在間接法和夾心法小鼠ELISA試劑盒中,陽(yáng)性孔呈色深于陰性孔。在競(jìng)賽法小鼠ELISA試劑盒中則相反,陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。兩類反響的成果判別辦法不一樣,分述于下。
(1)間接法和夾心法
這類反響的定性成果能夠用肉眼判別。目視標(biāo)本也無(wú)色或近于無(wú)色者判為陰性,顯色明晰者為陽(yáng)性。但在小鼠ELISA試劑盒中,正常人血清反響后??沙尸F(xiàn)呈色的本底,此本底的深淺因試劑的構(gòu)成和試驗(yàn)的條件不一樣而異,因而試驗(yàn)中有必要加測(cè)陰性對(duì)照。陰性對(duì)照的構(gòu)成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物(見(jiàn)3.6)。在用肉眼判別成果時(shí),更宜用顯色深于陰性對(duì)照作為標(biāo)本陽(yáng)性的目標(biāo)。
目視法簡(jiǎn)捷明晰,但頗具主觀性。在條件許可下,應(yīng)該用比色計(jì)測(cè)定吸光值,這么能夠得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本(sample,S)、陽(yáng)性對(duì)照(P)、和陰性對(duì)照(N)的吸光值,然后進(jìn)行核算。核算辦法有多種,大致可分為陽(yáng)性斷定值法和標(biāo)本與陰性對(duì)照比值法兩類。
a.陽(yáng)性斷定值
陽(yáng)性斷定值(cut-off value)通常為陰性對(duì)照A值加上一個(gè)特定的常數(shù),以此作為判別成果陽(yáng)性或陰性的規(guī)范。
用此法判別成果請(qǐng)求,小鼠ELISA試劑盒的制備有必要規(guī)范化,陽(yáng)性和陰性的對(duì)照品應(yīng)契合一定的規(guī)范,須配用精細(xì)的儀器,并嚴(yán)厲按規(guī)則操作。陽(yáng)性斷定值公式中的常數(shù)是在這特定的體系中經(jīng)過(guò)對(duì)很多標(biāo)本的試驗(yàn)檢查而得到的?,F(xiàn)舉某種檢查HBsAg的試劑盒為例。ELISA試劑盒中的陰性對(duì)照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,陽(yáng)性對(duì)照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml。每次試驗(yàn)設(shè)2個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和3個(gè)陰性對(duì)照。測(cè)得A值后,先核算陰性對(duì)照A值的平均數(shù)(NCX)和陽(yáng)性對(duì)照A值的平均數(shù)(PCX),兩個(gè)平均數(shù)的差(P-N)有必要大于一個(gè)特定的數(shù)值(例0.400),試驗(yàn)才有效。如其中之一超出此規(guī)模,則棄去,罷了另兩個(gè)陰性對(duì)照重新核算NCX;如有兩個(gè)陰性對(duì)照A值超出以上規(guī)模,則該次試驗(yàn)無(wú)效。陽(yáng)性斷定值按下式核算:
陽(yáng)性斷定值=NCX+0.05
標(biāo)本A值>陽(yáng)性斷定值的為陽(yáng)性,小于陽(yáng)性斷定值的為陰性。應(yīng)留意的是,式中0.05為該試劑盒的常數(shù),只適合于該特定條件下,ELISA試劑盒而不是對(duì)各種試劑均可通用。
依據(jù)以上敘說(shuō)能夠看出,在這種辦法中陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照也起到試驗(yàn)的質(zhì)控效果,試劑蛻變和操作不當(dāng)均會(huì)發(fā)生"試驗(yàn)無(wú)效"的成果。
b.標(biāo)本/陰性對(duì)照比值
在試驗(yàn)條件(包含試劑)較難確保穩(wěn)定的情況下,這種判別法較為適宜。在得出標(biāo)本(S)和陰性對(duì)照(N)的A值后,核算S/N值。也有寫(xiě)作P/N的,這里的P不代表陽(yáng)性(positive),而是患者(patient)的縮寫(xiě),不該誤解。為避免混淆,更宜用S/N表明。在前期的間接法ELISA試劑盒中,有些作者定出S/N為陽(yáng)性規(guī)范,現(xiàn)多為各種測(cè)定所沿用。實(shí)際上每一測(cè)定體系應(yīng)該用試驗(yàn)求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)留意的是,N所代表的陰性對(duì)照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對(duì)照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,致使反響后發(fā)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因而,這類試劑盒規(guī),如N<0.05(或別的數(shù)值),則按0.05核算,不然將呈現(xiàn)假陽(yáng)性成果。
(2)競(jìng)賽法
競(jìng)賽法小鼠ELISA試劑盒不易用自視判別成果,因肉眼很難區(qū)分弱陽(yáng)性反響與陰性對(duì)照的顯色差
異,通常均用比色計(jì)測(cè)定,讀出S、P和N的吸光值。核算辦法主要也有兩種,即陽(yáng)性斷定值法和按捺率法。
在競(jìng)賽法小鼠ELISA試劑盒中,陰性孔呈色深于陽(yáng)性孔。陰性呈色的強(qiáng)度取決于反響中酶物
的濃度和參加競(jìng)賽按捺物的量,通常調(diào)理陰性對(duì)照的吸光度在1.0-1.5之間,此刻反響zui為
靈敏。
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