国产精品视频一区二区三区四,亚洲av美洲av综合av,99国内精品久久久久久久,欧美电影一区二区三区电影

產(chǎn)品推薦:氣相|液相|光譜|質(zhì)譜|電化學(xué)|元素分析|水分測(cè)定儀|樣品前處理|試驗(yàn)機(jī)|培養(yǎng)箱


化工儀器網(wǎng)>技術(shù)中心>操作使用>正文

歡迎聯(lián)系我

有什么可以幫您? 在線咨詢

Random priming

來(lái)源:上海源葉生物科技有限公司   2010年12月18日 14:31  

DNA聚合酶要進(jìn)行DNA聚合反應(yīng)時(shí)一定要有引子 (primer),因?yàn)樗荒芤砸铀峁┑?’-OH為起始點(diǎn)進(jìn)行延伸 (extension) 的工作,而不能就地重新合成新的DNA (de novo synthesis)。 一般實(shí)驗(yàn)常以人工合成的寡核苷酸為引子進(jìn)行DNA聚合反應(yīng),這時(shí)固然可以根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)核酸引子,但也可以采用逢機(jī)引子(random primers)。 所謂逢機(jī)引子即其序列為逢機(jī)序列,不經(jīng)特別設(shè)計(jì),目前應(yīng)用zui廣者是以自動(dòng)化機(jī)器所合成的、六到八個(gè)核苷酸長(zhǎng)的寡核苷酸混合物;反應(yīng)進(jìn)行中若有任何一條逢機(jī)引子結(jié)合到模版DNA,即可引導(dǎo)DNA聚合反應(yīng)的進(jìn)行。 以random priming方法進(jìn)行核酸標(biāo)定,是以逢機(jī)引子引導(dǎo)Klenow fragment(large fragment of E. coli DNA polymerase I) 進(jìn)行DNA聚合反應(yīng),并在反應(yīng)過(guò)程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等標(biāo)定物質(zhì)。 而為了避免random priming也發(fā)生于載體部份的DNA,不要直接以質(zhì)體DNA為模版進(jìn)行標(biāo)定反應(yīng),而應(yīng)預(yù)先將目標(biāo)DNA自載體切除出來(lái)。

 
儀器用具:微量離心機(jī);沸水浴及冰浴
 
藥品試劑:
模版DNA (pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段,將由助教提供)
0.2 M EDTA, pH 8.0
4 M LiCl
Random priming kit (Roche):
Hexanucleotide mix (random primer)
dNTP mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35
mM DIG-11-dUTP, pH 7.5)
Klenow enzyme (2 U/μL)
酒精
70%酒精
TE (10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA)
 
方法步驟:
◆ 以下反應(yīng)條件與步驟主要參照random priming kit 制造廠商所提供的產(chǎn)品說(shuō)明書。
1) 取100 ng 模版DNA,加入適量去離子水,把體積補(bǔ)足為15 μL。
2) 于沸水中加熱10 min。
◆ 請(qǐng)記得以?shī)A子固定微量離心管的管蓋部份,以免離心管在加熱過(guò)程中蓋子爆開、進(jìn)水!
3) 加熱后,迅速把微量離心管移至冰浴中,靜置數(shù)分鐘。
4) 離心數(shù)秒后,依序加入下列三種試劑:
2 μL hexanucleotide mix
2 μL dNTP mixture
1 μL Klenow enzyme
5) 以指頭輕彈離心管,以便混合均勻。
6) 短暫離心后,置于37℃恒溫水槽中作用2 h。
◆ 反應(yīng)時(shí)間至少須要1 h,zui長(zhǎng)可反應(yīng)過(guò)夜。
7) 作用完畢的后,加入2 μL 的0.2 M EDTA,以便終止DNA 聚合反應(yīng)。
8) 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL純酒精,混合均勻,置 -20℃過(guò)夜。
隔天:
1) 于13,000 rpm,4℃離心15 min。
2) 倒出上清液,加入50 μL 的70%酒精,再離心5 min。
3) 倒出上清液并風(fēng)干DNA。
4) zui后以50 μL TE 溶解DNA。

免責(zé)聲明

  • 凡本網(wǎng)注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”的所有作品,均為浙江興旺寶明通網(wǎng)絡(luò)有限公司-化工儀器網(wǎng)合法擁有版權(quán)或有權(quán)使用的作品,未經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)不得轉(zhuǎn)載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經(jīng)本網(wǎng)授權(quán)使用作品的,應(yīng)在授權(quán)范圍內(nèi)使用,并注明“來(lái)源:化工儀器網(wǎng)”。違反上述聲明者,本網(wǎng)將追究其相關(guān)法律責(zé)任。
  • 本網(wǎng)轉(zhuǎn)載并注明自其他來(lái)源(非化工儀器網(wǎng))的作品,目的在于傳遞更多信息,并不代表本網(wǎng)贊同其觀點(diǎn)和對(duì)其真實(shí)性負(fù)責(zé),不承擔(dān)此類作品侵權(quán)行為的直接責(zé)任及連帶責(zé)任。其他媒體、網(wǎng)站或個(gè)人從本網(wǎng)轉(zhuǎn)載時(shí),必須保留本網(wǎng)注明的作品第一來(lái)源,并自負(fù)版權(quán)等法律責(zé)任。
  • 如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題,請(qǐng)?jiān)谧髌钒l(fā)表之日起一周內(nèi)與本網(wǎng)聯(lián)系,否則視為放棄相關(guān)權(quán)利。
企業(yè)未開通此功能
詳詢客服 : 0571-87858618
普定县| 阳山县| 娄底市| 崇州市| 康保县| 新竹市| 旺苍县| 巴林左旗| 游戏| 哈巴河县| 闽侯县| 晋州市| 阳山县| 玉屏| 萍乡市| 赤水市| 清苑县| 昌乐县| 儋州市| 英德市| 虞城县| 增城市| 莱芜市| 高安市| 芦溪县| 双辽市| 黔南| 沙雅县| 青铜峡市| 女性| 阿克苏市| 越西县| 长泰县| 陈巴尔虎旗| 渑池县| 阿瓦提县| 钦州市| 慈溪市| 江门市| 雷波县| 临城县|