ATCC細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)具有固有的形態(tài)特征,如細(xì)胞核表現(xiàn)縮小、染色質(zhì)邊緣化、凝集,凋亡晚期還會(huì)出現(xiàn)由核碎片與胞質(zhì)內(nèi)的部分細(xì)胞器混合在一起,且被細(xì)胞膜包裹形成的凋亡小體。
DNA特異性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區(qū)進(jìn)行非嵌入式結(jié)合,從而使細(xì)胞核著色,在紫外光激發(fā)時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的熒光。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)變化、膜結(jié)構(gòu)及通透性的改變,從而鑒別凋亡細(xì)胞、正常細(xì)胞及壞死細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果直觀,至今仍是判定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的金標(biāo)準(zhǔn),但觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)特征耗時(shí)費(fèi)力,不適于大量凋亡樣本的檢測。
細(xì)胞凋亡的DNA化檢測
DNAladder
提取凋亡細(xì)胞的基因組DNA,經(jīng)電泳后染色觀察可見180bp～200bp及其不同倍數(shù)的彌散狀DNA條帶,即DNAladder。DNAladder被視為經(jīng)典的檢測細(xì)胞凋亡的指標(biāo),但DNA凝膠電泳特異性雖高而靈敏度偏低,不適于檢測ATCC細(xì)胞凋亡初期DNA鏈的輕微損傷。
TUNEL檢測法
TUNEL法是一種將分子生物學(xué)和免疫組織化學(xué)相結(jié)合的原位檢測凋亡細(xì)胞DNA的方法。
其基本原理為:細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)核酸內(nèi)切酶被激活,染色質(zhì)或DNA被核酸內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生180bp～200bp的含3′-OH末端的片斷,脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶將結(jié)合有熒光素的核苷酸(dUTP)標(biāo)記到缺口3′-OH的末端,依次加入HRP抗熒光素抗體和HRP顯色底物DAB,凋亡細(xì)胞顯色明顯,而正常細(xì)胞沒有DNA斷裂或者只有少量的DNA發(fā)生斷裂,故不被顯色。
TUNEL法因其靈敏高而被廣泛用于各種凋亡細(xì)胞的檢測,由于在壞死細(xì)胞內(nèi)也可能存在DNA,所以只有DNA鏈普遍斷裂才能證明細(xì)胞發(fā)生凋亡。另外,在TUNEL法具體試驗(yàn)操作過程中,需要摸索細(xì)胞的固定及消化時(shí)間,以提高該技術(shù)的敏感性和獲得較低的背景值。
ELISA檢測法
應(yīng)用ELISA方法也可以檢測DNA,在凋亡的早期DNA發(fā)生斷裂,核小體釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中,核小體是染色質(zhì)的基本單元,通過ELISA檢測凋亡細(xì)胞釋放到細(xì)胞質(zhì)中的核小體從而確定細(xì)胞凋亡程度。
此方法既可定性又可以定量,而且適合檢測大批量樣本,不需要特殊的儀器。試驗(yàn)過程中如果裂解細(xì)胞的時(shí)間過長可能導(dǎo)致細(xì)胞核中的DNA片段也被計(jì)算在內(nèi),進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)果偏高,因此不同的ATCC細(xì)胞系需要經(jīng)過數(shù)次摸索才能確定*檢測條件。