微生物菌種步驟如下：

(1) 用 2.5% (體積比) 的戊二醛固定收集的細(xì)胞樣 0.5 h，與 1.25% (質(zhì)量體積比)水質(zhì)瓊脂混合；

(2) 將固定的瓊脂制成1 mm 的切片，繼續(xù)固定 0.5 h；

(4) 用超純水漂洗切片，在 1% (質(zhì)量體積比)鈾酰乙酸溶液中固定 1 h；

(5) 用乙醇和氧化丙烯進(jìn)行梯度脫水，將瓊脂切片植入環(huán)氧樹脂；

(6) 鈾酰乙酸染色后用于電鏡觀察。

5. 菌株分子生物學(xué)鑒定

5.1 基因組 DNA 的提?。翰捎脧纳ど锕こ?(上海)有限公司購(gòu)買的小量細(xì)菌基因組 DNA 快速提取試劑盒提取該菌株的基因組 DNA。

5.2 PCR 擴(kuò)增：細(xì)菌 16S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增。前端引物和后端引物分別為 27F (5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和 1492R (5′- GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)。50.0 μL 擴(kuò)增體系：10×Taq buffer 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μL，基因組 DNA 2.0 μL，10.0 μmol/L 前端引物和后端引物各 1.0 μL，rTaq 酶 0.5 μL，ddH2O 39.5 μL。反應(yīng)條件：94 °C 10 min；94 °C 45 s，55 °C 45 s，72 °C 90 s，共 35 個(gè)循環(huán)；72 °C 10 min。 1.5.3 16S rRNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建： PCR 產(chǎn)物進(jìn)行 B 型小 DNA 片段凝膠電泳。測(cè)序工作由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。將菌株 CYJN-1 的 16S rRNA 序列采用 NCBI 的 BLAST 軟件進(jìn)行同源性比對(duì)，用 ClustalX 1.81 和 MEGA 4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

6. CYJN-1 的生長(zhǎng)特性研究

6.1 不同能源物質(zhì)對(duì) CYJN-1 生長(zhǎng)的影響：為了確定 微生物菌種的zui適能源物質(zhì)，培養(yǎng)基中的硫代硫酸鈉被下面的物質(zhì)代替(g/L)：蛋白胨 1.0，葡萄糖 1.0，酵母提取物 1.0，乳糖 1.0，甘氨酸 1.0，賴氨酸 1.0，單質(zhì)硫 10.0，Na2SO310.0，DBT (二丙苯噻吩，有機(jī)硫模式化合物) 0.01mmol/L。接種量 5%，30 °C、170 r/min 培養(yǎng) 2 d，測(cè)定細(xì)胞濃度，將細(xì)胞濃度換算成菌落形成單位(Colony forming unit，CFU)。

6.2 不同溫度和初始pH對(duì)CYJN-1生長(zhǎng)的影響：適宜的溫度和 pH 環(huán)境同樣是硫細(xì)菌生長(zhǎng)所必需的條件。微生物胞內(nèi)酶和胞外酶的穩(wěn)定性均受溫度和 pH 值影響，過高過低直接影響菌種的生存及活力。為了確定細(xì)胞生長(zhǎng)的zui適溫度和 pH，CYJN-1 菌株在不同溫度(10、20、30、40、50 °C)和不同初始 pH 值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的培養(yǎng)基中 170 r/min 培養(yǎng) 2 d，測(cè)定細(xì)胞濃度。

6.3 不同底物濃度對(duì) CYJN-1 生長(zhǎng)的影響：向培養(yǎng)基中添加不同濃度的硫代硫酸鈉，分別為 5、10 和 20 g/L，調(diào)節(jié)起始 pH 為 7.0。取 100 mL 培養(yǎng)基置于 250 mL 錐形瓶中，接種 5%的菌液，在 30 °C、 170 r/min 條件下培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間測(cè)定細(xì)胞濃度。

7. CYJN-1 脫硫性能的測(cè)定本研究采用 Na2S 在空氣中的主要氧化產(chǎn)物 Na2S2O3 作為 S 2− 的來源。搖瓶實(shí)驗(yàn)中，5%的接種量接種在 100 mL 含硫培養(yǎng)液中，zui適培養(yǎng)條件下每 12 h 測(cè)定細(xì)胞濃度、S2O3 2− 濃度和 SO4 2− 濃度。

8. CYJN-1 耐鹽特性的研究在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入一定比例的 NaCl，形成不同的鹽濃度梯度，梯度范圍分別為 0、1%、3%、5% 和 7%，在zui適生長(zhǎng)條件下測(cè)定脫硫菌的生長(zhǎng)情況和微生物菌種脫除率。