細(xì)胞培養(yǎng)真菌污染定性熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細(xì)胞培養(yǎng)真菌污染定性熒光檢測試劑盒是一種旨在通過特異性真菌細(xì)胞壁結(jié)合熒光染料使活體真菌立刻染色，呈現(xiàn)絲狀體狀藍(lán)色熒光的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種人體和動物細(xì)胞培養(yǎng)中真菌（霉菌）污染的定性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，性能穩(wěn)定，檢測敏感，熒光清晰。

技術(shù)背景

細(xì)胞培養(yǎng)中的主要微生物污染包括支原體（mycoplasma）、細(xì)菌、真菌、酵母和病毒等。在含有抗生素的培養(yǎng)液中，低水平的真菌菌污染則難以觀察和發(fā)現(xiàn)。Fluorescence brightener 28，又稱為Calcofluor White M2R， 為一種特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁上纖維素（cellulose）和甲殼素（chitin），且紫外激發(fā)的藍(lán)色熒光染料，其分子式為C₄₀H₄₄N₁₂O₁₀S₂，分子量916.98。一旦結(jié)合真菌細(xì)胞壁，呈現(xiàn)強(qiáng)力的藍(lán)色熒光。細(xì)胞培養(yǎng)真菌污染定性熒光染色技術(shù)，通過Fluorescence brightener 28對真菌菌胞壁的染色，具有快速檢測細(xì)胞培養(yǎng)中真菌的存在，在熒光顯微鏡下（激發(fā)波長365nm，散發(fā)波長425nm）下觀察到藍(lán)色絲狀體。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）   毫升

 染色液（Reagent B） 微升

 堿性液（Reagent C） 微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存在-20℃冰箱里，避免光照； 堿性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

載玻片和蓋玻片：用于樣品染色的載體

臺式離心機(jī)：用于懸浮細(xì)胞操作

細(xì)胞培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿：用于培養(yǎng)細(xì)胞的容器

實(shí)驗(yàn)步驟

• 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)檢測

• 準(zhǔn)備好待測細(xì)胞培養(yǎng)至50％鋪滿率 
• 小心移取5毫升細(xì)胞培養(yǎng)容器里的培養(yǎng)液到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為1000g
• 小心抽掉上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為1000g
• 小心抽掉上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent A），混勻
• 移取20微升混勻液到潔凈的載玻片上
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，使其晾干
• 快速在酒精燈火上加熱固定（注意：切忌過熱處理）
• 加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液
• 加上xx微升 染色液（Reagent B）在載玻片上
• （選擇步驟）加上xx微升 堿性液（Reagent C）（注意：如果需要觀察真菌結(jié)構(gòu)成分）
• 蓋上蓋玻片
• 在室溫下，暗室里孵育5分鐘 
• （選擇步驟）移去蓋玻片，小心抽去染色液
• （選擇步驟）小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• （選擇步驟）小心抽去清理液
• 封片處理
• 置于熒光顯微鏡下觀察染（100至400倍放大倍數(shù)）：激發(fā)波長365nm，散發(fā)波長425nm（類同DAPI濾波器）

真菌呈現(xiàn)絲狀體藍(lán)色熒光

二、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)檢測

• 將待測懸浮細(xì)胞（1 X 10⁵總量）移入到15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為1000g 
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞顆粒群
• 移取20微升混勻液到潔凈的載玻片上
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱孵育10分鐘，使其晾干
• 快速在酒精燈火上加熱固定（注意：切忌過熱處理）
• 加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心抽去清理液
• 加上xx微升 染色液（Reagent B）在載玻片上
• （選擇步驟）加上xx微升 堿性液（Reagent C）（注意：如果需要觀察真菌結(jié)構(gòu)成分）
• 蓋上蓋玻片
• 在室溫下，暗室里孵育5分鐘 
• （選擇步驟）移去蓋玻片，小心抽去染色液
• （選擇步驟）小心加上xx微升 清理液（Reagent A）在載玻片上，覆蓋樣品
• （選擇步驟）小心抽去清理液
• 封片處理
• 置于熒光顯微鏡下觀察染（100至400倍放大倍數(shù)）：激發(fā)波長365nm，散發(fā)波長425nm（類同DAPI濾波器）

真菌呈現(xiàn)絲狀體藍(lán)色熒光

 注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 本產(chǎn)品可以檢測各種真菌菌株，例如Alternaria alternata、Stemphylium botryosum、Cladosporium herbarum、Geotrichum candidum、 P. parasitica、Pyt. Aniderphermatum、Pyt. Ultimum、Fusarium oxysporum、Rhizopus stolonifer、Botrytis cinerea等
• 操作時須戴手套
• 操作時，嚴(yán)格無菌操作
•  堿性液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 染色時，避免光照
• 細(xì)胞染色前后的清洗過程中，小心操作
• 如果有酵母污染，可見較大的球體或橢球體（elliposoid）、發(fā)芽體藍(lán)色熒光
• 如果為細(xì)胞碎片，通常可見不規(guī)則染色
• 本公司提供系列細(xì)胞培養(yǎng)污染檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰