銀染法細(xì)胞端粒酶活性TRAP電泳分析試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 銀染法細(xì)胞端粒酶活性TRAP電泳分析試劑是一種旨在通過端粒酶體外合成端粒重復(fù)序列的引物延展方法，繼而進(jìn)行多聚酶聯(lián)擴(kuò)增反應(yīng)，在非變性聚丙烯酰胺電泳上，通過經(jīng)典的銀染技術(shù)，呈現(xiàn)六堿基相間的階梯圖像，以分析和評價活細(xì)胞端粒酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實驗證明的。廣泛應(yīng)用于腫瘤、衰老等研究。產(chǎn)品即到即用，性能穩(wěn)定，無核酶污染，操作便捷，敏感，染色清晰，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

端粒重復(fù)序列擴(kuò)增方法（omeric repeat amplification protocol；TRAP）是基于多聚酶聯(lián)擴(kuò)增的敏感的體外端粒酶活性的檢測技術(shù)。首先，非端粒單核苷酸引物作為端粒酶的底物而持續(xù)延長產(chǎn)生六堿基差異的片段；然后，延長所獲得的產(chǎn)物在非端粒單核苷酸引物和逆向引物的參與下進(jìn)行特異性擴(kuò)增；內(nèi)參引物的整合用于定量酶活性。銀染技術(shù)可以檢測25至50皮克DNA條帶。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）  20毫升

 裂解液（Reagent B）   2毫升

 反應(yīng)液（Reagent C）        1毫升

 上樣液（Reagent D）      100微升

 膠底液（Reagent E）   6毫升

 凝結(jié)液（Reagent F）  1.5毫升

 促進(jìn)液（Reagent G） 200微升

 膠體液（Reagent H）  60毫升

 電泳液（Reagent I） 100毫升

 固定液A（Reagent J）       40毫升

 固定液B（Reagent K）      160毫升

 染色液（Reagent L）  40毫升

 中和液（Reagent M）  40毫升

 顯影液A（Reagent N） 300微升

 顯影液B（Reagent O） 300微升

 終止液（Reagent P）  40毫升

產(chǎn)品說明書       1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）、 裂解液（Reagent B）、 反應(yīng)液（Reagent C）和 凝結(jié)液（Reagent F）在－20℃冰箱里， 上樣液（Reagent D）和 促進(jìn)液（Reagent G）保存在4℃冰箱里；其余的保存在室溫下。 上樣液（Reagent D）、 膠底液（Reagent E）、 促進(jìn)液（Reagent G）、 膠體液（Reagent H）和 染色液（Reagent L），避免光照，有效保證6月

用戶自備

無離子水：用于染色使用的濃縮試劑

200毫升燒杯：用于配制工作液的容器

1.5毫升離心管：用于細(xì)胞裂解的容器

0.5毫升PCR管：用于擴(kuò)增反應(yīng)的容器

15毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器

50毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制和溶液混勻的容器

PCR儀：用于擴(kuò)增反應(yīng)物

微型臺式離心機(jī)：用于沉淀反應(yīng)物

電泳儀：用于TRAP分子電泳分離

平式搖蕩儀：用于染色反應(yīng)

染色塑料盒：用于PAGE凝膠染色的容器

自動成像儀或PHOSPHORIMAGE：用于電泳染色記錄

實驗步驟

• 樣品制備

• 準(zhǔn)備1個細(xì)胞培養(yǎng)6孔板的單孔細(xì)胞，直至生長至80％鋪滿率（1 X 10⁵細(xì)胞）
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入2毫升預(yù)冷的 清理液（Reagent A）
• 小心移去清理液
• 用細(xì)胞刮脫棒刮落細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽去上清液
• 小心加入100微升預(yù)冷的 裂解液（Reagent B），混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)冰槽里孵育30分鐘
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃冰箱里保存或置于冰槽里備用

• 擴(kuò)增反應(yīng)

• 準(zhǔn)備2個0.5毫升PCR管，置于冰槽里
• 按照下表依次加入反應(yīng)物

• 混勻
• 室溫下（30℃）孵育30分鐘
• 即刻放進(jìn)PCR儀，按照下表擴(kuò)增

• 分別加入5微升 上樣液（Reagent D）
• 置入冰槽里等待上樣

• 垂直電泳分析

實驗開始前，將 膠底液（Reagent E）、 凝結(jié)液（Reagent F）、 促進(jìn)液（Reagent G）和 膠體液（Reagent H）放進(jìn)37℃恒溫水槽預(yù)熱。然后進(jìn)行下列操作。

• 移出3毫升 膠底液（Reagent E）到15毫升錐形離心管里
• 加入100微升 凝結(jié)液（Reagent F）
• 加入10微升 促進(jìn)液（Reagent G）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結(jié)
• 移出30毫升 膠體液（Reagent H）到50毫升錐形離心管里
• 加入600微升 凝結(jié)液（Reagent F）
• 加入60微升 促進(jìn)液（Reagent G）
• 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡
• 插入10孔梳
• 在室溫下孵育45分鐘，或直至膠體凝結(jié)
• 移取50毫升 電泳液（Reagent I）到500毫升容器里，加入450毫升無離子水，混勻后，標(biāo)記為 電泳工作液
• 加入適量的 電泳工作液到電泳槽里
• 在4℃環(huán)境下預(yù)運行15分鐘，電壓為150伏
• 上樣：25微升（注意：使用20堿基的DNA marker）
• 繼續(xù)4℃環(huán)境下電泳2小時，電壓為150伏，或直至溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue）染料移動到膠體三分之二處
• 拆除電泳裝置，取出電泳玻璃板塊（注意：膠體脆弱）
• 分離玻璃板快，切除膠底
• 將膠體放進(jìn)染色塑料盒里

• 染色處理

• 小心加入20毫升 固定液A（Reagent J）到上述塑料盒里
• 小心加入80毫升 固定液B（Reagent K），混勻
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM
• 小心倒去固定液
• 小心加入80毫升用戶自備的無離子水
• 小心加入20毫升 染色液（Reagent L）
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM，避免光照
• 小心倒去 染色液（Reagent L）
• 小心加入100毫升用戶自備的無離子水
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育1分鐘，速度為50RPM
• 小心倒去無離子水
• 準(zhǔn)備1個200毫升燒杯
• 加入80毫升用戶自備的無離子水
• 加入20毫升 中和液（Reagent M）
• 加入100微升 顯影液A（Reagent N）
• 加入100微升 顯影液B（Reagent O），混勻
• 小心倒入塑料盒里
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育6分鐘，速度為50RPM（注意：可見金黃色條帶；避免過度染色）
• 小心倒去顯影液
• 小心加入80毫升用戶自備的無離子水
• 小心加入20毫升 終止液（Reagent P），混勻
• 置于平式震蕩儀上，在室溫下孵育30分鐘，速度為50RPM（注意：可以保存在終止液里）
• 小心取出膠體
• 即刻置于自動成像儀上或PHOSPHORIMAGE下成像記錄，并測算條帶強(qiáng)度
• 計算端粒酶活性：

所有階梯條帶強(qiáng)度累加之和÷內(nèi)參條帶強(qiáng)度＝相對TRAP活性   

注意事項

• 本產(chǎn)品為10次操作（包括10次裂解、20次反應(yīng)、2次電泳）
• 整個操作過程，須戴手套
• 必須使用帶濾芯的槍頭
• 所有器皿、離心管、液體等無RNA酶污染
• 建議使用裂解液作為陰性對照
• 內(nèi)參分子大小為36bp
• 內(nèi)參條帶信號過弱，表明端粒酶活性過高，建議稀釋或減少樣品量；建議實驗操作增加樣品濃度梯度
• 電泳前注意清洗樣品孔
• 電泳操作注意安全
• 染色時，須在室溫下操作，并避免光照；避免過度染色
• 染色時間可以根據(jù)情況調(diào)整（參考圖像如下：黑色箭頭指示內(nèi)參條帶36堿基；括號區(qū)域表明六堿基相間的陽性條帶，起始條帶為50堿基）

• 本公司提供系列TRAP實驗技術(shù)產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無核酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定顯帶清晰