真菌/酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧初級熒光測定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

  真菌/酵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧初級熒光測定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑二氯熒光乙酰乙酸鹽，在細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種實(shí)驗(yàn)用真菌/酵母菌株細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧的分析。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡易，活體檢測，性能穩(wěn)定，熒光清晰。

技術(shù)背景

真菌/酵母細(xì)胞是一種低等單細(xì)胞真核生物，具有細(xì)胞生長快，易于培養(yǎng)，遺傳操作簡單明了等原核生物的特點(diǎn)。作為模式生物，它具有比較完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾能力，在分子遺傳學(xué)方面認(rèn)識zui早，zui先作為外源基因表達(dá)的細(xì)胞宿主。超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。2',7'-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2',7'-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）一種*自由通過細(xì)胞膜的染色劑。一旦被過氧化氫、過氧化基、過氧亞硝基陰離子等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測定細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。據(jù)此測定細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

  清理液（Reagent A）    200毫升

  染色液（Reagent B）    500微升

  稀釋液（Reagent C）     50毫升

  溶解液（Reagent D）     25毫升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存  染色液（Reagent B）在－20℃冰箱里，嚴(yán)格避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于真菌/酵母染色的容器

載玻片：用于染色觀察

微型臺式離心機(jī)：用于沉淀真菌/酵母細(xì)胞

培養(yǎng)箱或恒溫水槽：用于染色孵育

比色皿：用于熒光定量分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于細(xì)胞熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞熒光分析

熒光分光光度儀：用于細(xì)胞熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的  染色液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后移出10微升  染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，加入990微升  稀釋液（Reagent C），混勻后，標(biāo)記為  染色工作液，置入冰槽里。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備好1毫升新鮮的酵母菌液（OD600＝1至2；1 X 10⁷細(xì)胞/毫升）
• 移入到1.5毫升離心管
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的  清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟5至7一次
• 加入1毫升含有  染色液（Reagent B）和  稀釋液（Reagent C）的  染色工作液，混勻（注意：參見注意事項(xiàng)7）
• 放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里或恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入1毫升預(yù)冷的  清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為3000g（或6000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心抽掉上清液
• 加入500微升預(yù)冷的  清理液（Reagent A），混勻
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長488nm氬離子激光，觀察50000個細(xì)胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測）：

1）移取5微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm――

綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測（定量檢測）：

1）移取500微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色杯

2）加入500微升  溶解液（Reagent D）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）室溫下，靜置15分鐘，避免光照

5）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為50次操作
• 操作時，須戴手套
• 操作時，避免污染母液
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測分析
• 孵育時，必須避免光照
• 本產(chǎn)品染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據(jù)不同菌株類型，可以調(diào)整  染色工作液的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供陽性對照甲萘醌溶液（GMS12041），觀察細(xì)胞熒光增強(qiáng)現(xiàn)象
• 本公司同時提供  真菌/酵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)活性氧高質(zhì)熒光測定試劑盒（GMS10016.7），滿足不同用戶需求
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰