對培養(yǎng)的NK細(xì)胞不滿意，是培養(yǎng)基的問題，還是試劑盒的問題？

關(guān)于NK細(xì)胞培養(yǎng)的問題，不能只認(rèn)為培養(yǎng)基不好或試劑盒不好，很多客戶在培養(yǎng)過程中遇到接種密度的問題、補(bǔ)液程序的問題、血漿問題以及樣本的問題，所以影響NK細(xì)胞培養(yǎng)效果的因素非常之多，那么在細(xì)胞培養(yǎng)不太滿意的情況下，我們應(yīng)該按以下原則進(jìn)行排查。

1、血液樣本問題

首先確認(rèn)樣本的狀態(tài)，理論上來講外周血樣本應(yīng)在抽取的6個小時內(nèi)進(jìn)行細(xì)胞分離，這個時段細(xì)胞是處于的狀態(tài)，所以培養(yǎng)前請確認(rèn)樣本是否新鮮，以及血液是否出現(xiàn)溶血現(xiàn)象：

血液樣本保存時間過長，會導(dǎo)致單核細(xì)胞無法成功誘導(dǎo)激活。

血液如在運送過程中溶血，則可能導(dǎo)致血漿分離出現(xiàn)問題，無法后期培養(yǎng)添加。

如用凍存的單個核細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，請確認(rèn)復(fù)蘇單個核細(xì)胞的活率及狀態(tài)。

2、接種密度問題

請確保接種的密度在1.5-2x10⁶cells/m L，過低密度會導(dǎo)致細(xì)胞前期增殖緩慢，無法達(dá)到補(bǔ)液要求。

3、血漿的處理及添加方式

（1）血漿必須要56℃滅活30min，除去多余的纖維蛋白，如有可能冷凍后離心，保證細(xì)胞培養(yǎng)時添加的血漿不會有纖維蛋白析出粘連正常細(xì)胞。

（2）如有可能有更多剩余的血漿，可在后期補(bǔ)入，對于有些狀態(tài)較差的樣本會有更好的培養(yǎng)效果。

4、補(bǔ)液原則問題

NK培養(yǎng)受樣本差異性影響會很大，所以沒有一個固定的補(bǔ)液程序可以指導(dǎo)各種不同的樣本。

有的樣本激活迅速，生長快速，補(bǔ)液就相對容易，也更好擴(kuò)增，可有的樣本前期就長的較慢，如遇到腫瘤患者晚期年老的病人，更是難上加難，所以針對不同的樣本，我們應(yīng)該有不同的應(yīng)對原則：

（1）首先7天以后的補(bǔ)液原則是補(bǔ)液后細(xì)胞密度應(yīng)在0.5-0.8x10⁶cells/m L，如密度達(dá)不到，請延遲一天后再進(jìn)行補(bǔ)液，否則當(dāng)你細(xì)胞補(bǔ)液密度過低時，好的樣本可以長起來，那差的樣本就會逐漸凋亡，無法繼續(xù)培養(yǎng)。

（2）對于差的樣本，適當(dāng)增加血漿的添加次數(shù)，可以得到更好的效果，比如標(biāo)準(zhǔn)程序需要加3-4次血漿，那么有可能的話你可以加到5次。

5、操作原因

（1）補(bǔ)液培養(yǎng)基的溫度

培養(yǎng)基補(bǔ)液前應(yīng)提前預(yù)溫，過冷的培養(yǎng)基會導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，出現(xiàn)絮狀物；

（2）培養(yǎng)箱環(huán)境的劇烈變化

培養(yǎng)箱異常，溫度及二氧化碳濃度變化較大會導(dǎo)致細(xì)胞死亡，出現(xiàn)絮狀物；

（3）細(xì)菌、真菌、支原體污染

受到細(xì)菌、真菌、支原體污染的細(xì)胞生長非常緩慢，甚至不生長；

（4）因子試劑盒經(jīng)過了反復(fù)的凍融

反復(fù)凍融會大大降低因子的活性，激活、誘導(dǎo)、擴(kuò)增等環(huán)節(jié)都會出現(xiàn)問題，達(dá)不到*的效果。