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β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法

來源:上海易佰聚經(jīng)貿(mào)有限公司   2011年02月27日 16:56  

β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法

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1.常規(guī)方法

(1).微生物法:

[原理]以一種對青霉素高度敏感的細(xì)菌-枯草芽孢桿菌作為指示劑,試驗時如果被測細(xì)菌株產(chǎn)生青霉素酶,破壞了青霉素,則此高度敏感菌株即可生長,否則,指示劑則被抑制。

[方法]以枯草芽孢桿菌為指示菌,用棉拭子將枯草芽孢桿菌接種于瓊脂培養(yǎng)基上,或傾注方法將枯草芽孢桿菌混于瓊脂平板內(nèi)。然后將被測菌與產(chǎn)青霉素酶陽性及陰性對照菌株,按下圖接種劃線,在瓊脂培養(yǎng)基中央放置一含青霉素G1單位)紙片。放置35培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。

[結(jié)果判斷]如被檢菌產(chǎn)生青霉素酶,則沿著被測菌處的枯草芽孢桿菌抑菌環(huán)出現(xiàn)凹痕。


 

 

(2).碘量法[3]

[原理]β-內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β-內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸,它與淀粉競爭游離碘,破壞了碘和淀粉的蘭色復(fù)合物,使蘭色變?yōu)闊o色。

[方法]

0.25克青霉素溶于41.7mlPH6.0的磷酸鹽緩沖液中,使其濃度成6000ug/ml。取0.1ml于一小試管中。

將培養(yǎng)18-24小時的細(xì)菌在含青霉素試管內(nèi)制成濃厚菌懸液(109/ml)。

37水浴中放置30分鐘,不時搖動,使酶能破壞青霉素。

加入1%可溶性淀粉溶液0.5ml,搖勻。

加入碘液0.02 ml

37水浴中放置10分鐘,觀察結(jié)果。

[結(jié)果]10分鐘內(nèi)能使蘭色*消退的菌株為β-內(nèi)酰胺酶陽性,不消退者為陰性。

[注意事項]

由于青霉素很容易分解,因而用于實驗的青霉素應(yīng)新鮮配制。

淀粉也新鮮配制,在100ml蒸餾水中加入1克可溶性淀粉,放到開水中水浴直到淀粉溶解。

實驗應(yīng)按照步驟操作,如果碘加得過早,酶反應(yīng)就會停止,產(chǎn)生假陰性結(jié)果。

每次試驗用陽性和陰性對照。

3.紙片酸度定量法[3]

[原理]β-內(nèi)酰胺酶能破壞青霉素中的β-內(nèi)酰胺環(huán),形成青霉噻唑酸,使PH降低,指示劑溴甲酚紫顏色由紫變黃。

[方法]

將一小片Whatman濾紙放于空平皿中。

讓濾紙吸足青霉素溶液(0.05M磷酸緩沖液,PH8.0+0.2%溴甲酚紫+5%無緩沖劑的結(jié)晶青霉素)。

用接種環(huán)把10-20個菌落涂到濾紙上,

蓋好平皿后,將濾紙片在37孵育30分鐘,觀察結(jié)果。

[結(jié)果] 產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的菌株使濾紙顏色由蘭色變黃色,一般在10分鐘內(nèi)即能看到。

4.產(chǎn)色頭胞菌素法[4]

[原理]產(chǎn)色頭胞菌素如頭胞硝噻吩(nitrocefin)的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶所破壞,使其顏色由淺黃色變?yōu)榉奂t色,以此來測定細(xì)菌的產(chǎn)酶情況。

[方法]將頭胞硝噻吩(nitrocefin)紙片置于干凈的平皿內(nèi),用無菌的牙簽或接種環(huán)挑取細(xì)菌菌落涂于紙片上,觀察紙片有無顏色變化。

[結(jié)果]紙片涂抹處如顏色由淺黃色變成粉紅色,表示該菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶,如顏色不變,表示細(xì)菌不產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶。

檢測β-內(nèi)酰胺酶方法中,生物學(xué)方法是古老的方法,由于特異性差、靈敏度低,現(xiàn)在基本上很少被采用,頭胞硝噻吩(nitrocefin)主要檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌(布拉漢氏菌)、葡萄球菌,結(jié)果可靠。紙片酸度定量法一般用于檢測淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌和葡萄球菌。碘量法常用于檢測淋病奈瑟氏菌,但莫拉氏菌(布拉漢氏菌)只能用頭胞硝噻吩(nitrocefin)法。

對于淋病奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌、莫拉氏菌(布拉漢氏菌)快速測定β-內(nèi)酰胺酶比做藥敏試驗?zāi)芨斓氐玫脚R床需要的結(jié)果。β-內(nèi)酰胺酶試驗還可驗證葡萄球菌對紙片法青霉素的敏感試驗結(jié)果是否可信。腸桿菌科、假單胞菌科及其它需氧革蘭氏陰性桿菌不必測定β-內(nèi)酰胺酶,因其結(jié)果常常不能預(yù)測這類細(xì)菌對臨床常用來治療β-內(nèi)酰胺類抗生素藥物的敏感性[5]。

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