人生如戲，相信長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）也體會(huì)到了。之前一直遭冷遇，如今卻是萬(wàn)人迷。其實(shí)，人類及其他哺乳動(dòng)物的基因組轉(zhuǎn)錄了數(shù)萬(wàn)條lncRNA。根據(jù)GenCode數(shù)據(jù)庫(kù)中版本的數(shù)據(jù)，人類基因組中包含16,000條lncRNA，產(chǎn)生了近28,000條轉(zhuǎn)錄本。再加上其他數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)，目前已知的lncRNA超過(guò)40,000條。  這些類似mRNA的轉(zhuǎn)錄本在各種基因調(diào)控水平和胚胎發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用。越來(lái)越多的證據(jù)也表明，異常表達(dá)的lncRNA在多種疾病狀態(tài)中發(fā)揮重要作用，如癌癥。這些RNA盡管在十幾年前就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，但只有少數(shù)分子的功能得到鑒定。  

德克薩斯大學(xué)西南醫(yī)學(xué)中心的藥理學(xué)教授David Corey表示：“你必須從檢測(cè)非編碼轉(zhuǎn)錄本開(kāi)始。”他的研究方向是將lncRNA作為藥物靶點(diǎn)。“我對(duì)這些數(shù)據(jù)庫(kù)不感冒，因?yàn)榭赡艽嬖阱e(cuò)誤。他們可能檢測(cè)到你的細(xì)胞系中不存在的RNA或很少量的RNA。”  若并非全基因組范圍內(nèi)的檢測(cè)，Corey博士通常利用定量PCR來(lái)檢測(cè)非編碼轉(zhuǎn)錄本。“如果我們認(rèn)為那兒有一條非編碼轉(zhuǎn)錄本，我們就用5’和3’ RACE來(lái)擴(kuò)增和檢測(cè)這些區(qū)域，”他說(shuō)。“了解它的起始位點(diǎn)和終止位點(diǎn)是件好事，但不一定是必需的。如果你主要對(duì)功能感興趣，那么就不用了解全部情況，若存在重疊的轉(zhuǎn)錄本，檢測(cè)起來(lái)也比較困難。”  

如果轉(zhuǎn)錄本的確存在，下一步則是利用逆轉(zhuǎn)錄來(lái)生成RNA，“或者購(gòu)買一條適當(dāng)長(zhǎng)度的RNA，但是序列必須相同，”Corey博士說(shuō)。“你必須使用*相同的qPCR引物，否則失之毫厘，謬以千里。”  當(dāng)然，與mRNA相比，分析這些lncRNA面臨*的挑戰(zhàn)。據(jù)ArrayStar的資深科學(xué)家Yanggu Shi介紹，lncRNA的豐度水平通常比mRNA低十倍，而且組織特異性高，近80%的lncRNA是組織特異的，但mRNA不到20%。lncRNA的注釋比較少，因?yàn)樗鼈儾痪幋a蛋白質(zhì)。此外，一些lncRNA沒(méi)有poly(A)尾。它們大多位于細(xì)胞核中。“基于這些原因，我們需要一些特殊方法來(lái)分析和注釋，”Shi博士說(shuō)。ArrayStar專門開(kāi)發(fā)分析RNA表達(dá)和調(diào)控的工具，特別是調(diào)控性的非編碼RNA。

 舉個(gè)例子，RNA測(cè)序通常產(chǎn)生4000萬(wàn)條序列，但lncRNA的測(cè)序覆蓋度太低，不足以進(jìn)行可靠定量。“利用這種方法，lncRNA測(cè)序至少需要1億條序列，比常規(guī)的mRNA測(cè)序要多得多，”Shi博士解釋道。“相比之下，芯片受低豐度轉(zhuǎn)錄本的影響沒(méi)那么大，且錯(cuò)誤定量的幾率較低。”  據(jù)Shi博士介紹，ArrayStar的lncRNA芯片帶有許多注釋，得到實(shí)驗(yàn)支持，并被許多文獻(xiàn)引用。比如，ArrayStar芯片曾出現(xiàn)在《Nature Cell Biology》的一篇論文中，說(shuō)明三陰乳腺癌中的細(xì)胞質(zhì)LINK-A lncRNA激活了常氧下的HIF1α信號(hào)通路1。  詳細(xì)了解康成生物的ArrayStar lncRNA芯片技術(shù)服務(wù)  zui近，lncRNA序列的系統(tǒng)分析也取得了很大進(jìn)展。Broad研究院（現(xiàn)科羅拉多大學(xué)）的John Rinn博士系統(tǒng)分析了影響核定位的lncRNA序列。他們開(kāi)發(fā)出一種大規(guī)模并行報(bào)告檢測(cè)（MPRA），可鑒定出38種人類lncRNA中與核富集相關(guān)的序列。這項(xiàng)成果于2017年9月發(fā)表在預(yù)印本bioRxiv上2。  “大規(guī)模并行報(bào)告檢測(cè)對(duì)DNA很有用，”Rinn博士說(shuō)。“它們挖掘出一切看似活躍的東西，并確定哪些是真正活躍的。我們也需要類似的技術(shù)來(lái)研究RNA的核富集。因此，我們將100,000條寡核苷酸混合在一起，看看哪些能將細(xì)胞質(zhì)的報(bào)告基團(tuán)帶回細(xì)胞核。只要你選擇活躍或非活躍，我們就能將它們分開(kāi)。”

 利用這種方法，Rinn博士及其團(tuán)隊(duì)鑒定出109個(gè)*且保守的核富集區(qū)，它們來(lái)自29個(gè)不同的lncRNA。他們還在核富集區(qū)中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)較短的motif，并利用單分子RNA熒光原位雜交（smRNA-FISH）進(jìn)一步驗(yàn)證了幾個(gè)區(qū)域是否足以影響核定位。  “對(duì)于RNA而言，這一切都?xì)w結(jié)為結(jié)構(gòu)，”Rinn博士說(shuō)。“以研究zui為透徹的RNA為例，端粒酶RNA（TERC）。它是生存所必需的。酵母和人類的端粒酶的大小和序列不同，但它們可以交換，仍然起作用。進(jìn)化并沒(méi)有保留這個(gè)基因的序列，但保留了它的結(jié)構(gòu)和結(jié)合伴侶。通過(guò)這種分析，我們可以改變序列，但保留結(jié)構(gòu)，看看它們是否仍然能結(jié)合。”  Corey博士則在繼續(xù)尋找可能成為治療靶點(diǎn)的lncRNA。“目前，我們特別感興趣的是一個(gè)內(nèi)含子中的重復(fù)擴(kuò)增，它與Friedrich共濟(jì)失調(diào)相關(guān)聯(lián)，”他說(shuō)。“如果我們能夠上調(diào)這個(gè)靶點(diǎn)，則有望治療這種疾病。”