細(xì)胞原代培養(yǎng)

• 胰酶消化法

1. 1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置 75%酒精泡 2—3 秒鐘(時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)、以免酒精從口和肛門浸入體內(nèi))再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)(或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi))解剖取肝臟，置平皿中。
2. 2、用 Hank’s 液洗滌三次，并剔除脂肪，結(jié)締組織，血液等雜物。
3. 3、用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊(1mm2)，再用 Hank’s 液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
4. 4、視組織塊量加入 5—6 倍的 0.25%胰酶液，37℃中消化 20—40 分鐘，每隔 5 分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細(xì)胞分離。
5. 5、加入 3—5ml 培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑)。
6. 6、靜置 5—10 分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7. 7、1000rpm，離心 10 分鐘，棄上清液。
8. 8、加入 Hank’s 液 5ml，沖散細(xì)胞，再離心一次，棄上清液。
9. 9、加入培養(yǎng)液 l—2 ml(視細(xì)胞量)，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
10. 10、將細(xì)胞調(diào)整到 5×105/ml 左右，轉(zhuǎn)移至 25ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng)。

上述消化分離的方法是zui基本的方法，在該方法的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步分離不同細(xì)胞。細(xì)胞分離的方法各實(shí)驗(yàn)室不同，所采用的消化酶也不相同(如膠原酶，透明質(zhì)酶等)。

• 組織塊直接培養(yǎng)法

自上方法第 3 步后，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入 37℃ 靜置 3—5 小時(shí)，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中(勿使組織漂起)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。

• 貼壁細(xì)胞傳代方法

1. 1、吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液。
2. 2、加入1-2 mL 0.25%的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個(gè)瓶底為準(zhǔn))靜置 2-10min(顯微鏡下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)) 。
3. 3、吸去胰蛋白酶液，加入培養(yǎng)液。
4. 4、吸取瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液。
5. 5、吸取細(xì)胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
6. 6、加適量新鮮培養(yǎng)液于新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。
7. 7、將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。