MS 培養(yǎng)液的配置

MS 大量元素母液的配制

一般將大量元素配制成 10 倍的母液，使用時(shí)再稀釋 10 倍。按照配方表中用量依次分別稱取擴(kuò)大 10 倍的：NH4NO₃、 KNO₃ ,KH₂PO4、MgSO4.7H₂O、CaCl2.2H₂O 的量，所有藥品稱取完畢后用蒸餾水逐個(gè)溶解，待全部溶解后，zui后定容至 1000ml，轉(zhuǎn)入 1000ml 細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

MS 微量元素母液的配制

一般將微量元素配制成 100 倍的母液，使用時(shí)再稀釋 100倍。

按照配方表中用量分別依次稱取：MnSO4 ?4H2O、ZnSO4?7H2O 、

H2BO3 、NaMoO4?2H2O、 CuSO4?5H2O、 C℃l2?6H2O 擴(kuò)大 100 倍的量，用蒸餾水逐個(gè)溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至

1000ml，轉(zhuǎn)入 1000ml 細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

MS 鐵鹽母液配制

一般將鐵鹽配制成 100 倍的母液，使用時(shí)再稀釋 100 倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大 100 倍的：FeSO₄—7H₂O 和 Na₂— EDTA—2H₂O 的量，把 FeSO₄—7H₂O 和 Na₂—EDTA—2H₂O 分別置于 200ml 蒸餾水中，加熱并不斷攪拌使之溶解(磁力攪拌器，邊加熱，邊攪拌)。保持加熱，把 FeSO₄ 溶液慢慢倒入 Na₂—EDTA 溶液中并不斷攪拌，接近沸騰時(shí)停止加熱，待溶液冷卻后加蒸餾水到zui終容積 1000ml，置于棕色細(xì)口瓶中，用力振蕩 1～2min，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、放大倍數(shù)、配制日期、配制人姓名。在室溫下避光保存一段時(shí)間令其充分反應(yīng)后，再置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

MS 有機(jī)化合物母液的配制

一般將有機(jī)化合物配制成 100 倍的母液，使用時(shí)再稀釋 100 倍。按照配方表中用量分別稱取擴(kuò)大 100 倍的：肌醇、維生素 B1、煙酸、甘氨酸、維生素 B6 的量，用蒸餾水依次溶解并定容至 500ml 后，轉(zhuǎn)入 500ml 細(xì)口試劑瓶中，貼上標(biāo)簽，注明母液名稱、配制日期、配制人姓名，置于 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/span>

植物激素的配制

常見激素：二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸 (IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)、激動(dòng)素(6-糠氨基嘌呤、 KT)、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、赤霉素(GA3)。

生長素類：

1. 生長素類在組織培養(yǎng)中的主要作用是：誘導(dǎo)細(xì)胞的分裂和根的分化，誘導(dǎo)愈傷組織
2. 常見生長素：二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚-3-丁酸(IBA)。NAA、IAA、IBA 被廣泛用于生根，2，4-D 有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和生長。IAA 容易光解，注意用棕色試劑瓶保存，保存時(shí)間不要太久。
3. 溶解方法：用少量 1mol/L NaOH 或 95%酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容，以前者為好。
4. 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存

細(xì)胞分裂素

組織培養(yǎng)中，細(xì)胞分類素主要促進(jìn)細(xì)胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。細(xì)胞分裂素常常與生長素相互配合，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，細(xì)胞伸長，細(xì)胞分化和器官形成。

1. 常用的細(xì)胞分裂素有： 6-芐氨基嘌呤(6-BA)、激動(dòng)素(6-糠氨

基嘌呤、 KT)、玉米素(ZT)、噻二唑苯基脲( thidiazuron、 TDZ )。

1. 溶解方法：用少量(1ml)1mol/L HCL 預(yù)溶解，再加蒸餾水定容。
2. 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存。

赤霉素(GA3)

1. 溶解方法：用少量 95%酒精預(yù)溶解，再加蒸餾水定容。
2. 保存：配成一定濃度后，冰箱冷藏保存。
3. 赤霉素易溶于水，但溶于水后不穩(wěn)定，容易分解。
4. 滅菌：高溫易分解，要過濾滅菌。

脫落酸

1. 溶解：易溶于 NaHCO3 溶液、氯fang或丙酮。
2. 保存：具有熱穩(wěn)定性，但容易發(fā)生光解。配成一定濃度后，冰箱冷藏保存。

培養(yǎng)基的制備與滅菌

培養(yǎng)基的制備

1. 將所需的各種母液和植物激素按順序放好，將潔凈的各種玻璃器皿等放在位置。
2. 取燒杯一個(gè)內(nèi)盛 200ml 蒸餾水，按照培養(yǎng)基配方所需量依次取母液和植物激素加入燒杯，攪拌，按相應(yīng)培養(yǎng)基稱量蔗糖和瓊脂，并添加到燒杯中，在電爐上加熱待瓊脂*融化后加蒸餾水定容至所需體積。
3. 充分混合后，用 1mol/LNaOH 和 1mol/LHCl 調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的 pH 為培養(yǎng)基要求 pH 值。
4. 趁熱把培養(yǎng)基分裝到廣口瓶中。封好瓶口。待滅菌。

培養(yǎng)基的滅菌

滅菌溫度及滅菌時(shí)間：121℃(1.06kg/cm2)下滅菌 20 分鐘。(如是實(shí)驗(yàn)所用菌材滅菌，如無菌水及器械，則是 121℃(1.06kg/cm2) 下滅菌 30 分鐘)

1. 檢查滅菌鍋外層鍋內(nèi)水位，水量過少時(shí)應(yīng)加水。把分裝好的培養(yǎng)基放入滅菌鍋的消毒桶內(nèi)。
2. 蓋上鍋蓋，注意按照說明操作并確定已蓋好，設(shè)置好溫度和時(shí)間參數(shù)，開啟電源加熱滅菌。
3. 滅菌時(shí)間到后，先切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，待滅菌鍋壓力表指針降到 0 時(shí)，打開排氣閥，旋松螺栓，開啟鍋蓋，取出已滅菌的培養(yǎng)基。
4. 剛滅過菌的培養(yǎng)基成液體狀，取出時(shí)不要用力搖動(dòng)，否則會(huì)導(dǎo)致部分培養(yǎng)基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷卻。在室溫下放置 1-2 天，觀察有無微生物生長，以確定培養(yǎng)基是否*滅菌。經(jīng)檢查沒有雜菌生長的方可使用。

無菌操作技術(shù)和接種

1. 接種前，用 75%酒精棉球擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面，將培養(yǎng)基及接種用具放入超凈工作臺(tái)臺(tái)面，打開超凈工作臺(tái)紫外燈及接種房間紫外燈，照射約 30min，然后關(guān)閉紫外燈。打開房間換氣扇及微開超凈工作臺(tái)的玻璃擋板，通風(fēng) 20min 后，即可進(jìn)行無菌操作。(此步由專人統(tǒng)一負(fù)責(zé))
2. 接種室滅菌過程中同時(shí)對(duì)外植體進(jìn)行表面滅菌。先將接種材料在流動(dòng)的自來水下涮洗干凈，吸干水份后切成大約 70mm 長的片段放進(jìn) 500ml 燒杯中，用蒸餾水沖洗 2 次，倒掉蒸餾水后倒入 0.1%的升gong水消毒，將材料淹沒浸泡約 10 分鐘(期間用鑷子攪拌幾次)。
3. 把在消毒液中的接種材料轉(zhuǎn)移到超凈工作臺(tái)上。用無菌鑷子將已完成滅菌的接種材料轉(zhuǎn)移到燒杯中，用無菌水清洗3次，每次不少于 1 分鐘，洗時(shí)不斷搖動(dòng)燒杯以確保*除去消毒液。zui后一次清洗后轉(zhuǎn)移到無菌托碟上，將接種材料切成一定大小(花托 0.5cm2、莖段 0.5-1cm)。
4. 取下培養(yǎng)瓶的蓋子用火燒灼瓶口。用鑷子將外植體輕輕插入到瓊脂上，立即蓋上蓋子。
5. 操作完后將鑷子等器械浸入 75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是將浸于酒精中的器械取出后置于酒精燈火焰上充分灼燒，待冷卻后方可使用。
6. 將培養(yǎng)瓶放到培養(yǎng)箱里，在要求溫度下培養(yǎng)，觀察記錄。