植物細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 植物細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧（ROS）高質(zhì)熒光測(cè)定試劑是一種旨在通過透膜熒光染色劑氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯，在組織細(xì)胞氧化條件下，產(chǎn)生熒光，來定量檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種新鮮植物組織（例如根尖、葉片等）和培養(yǎng)細(xì)胞等細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激活性氧的分析。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老和代謝等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)易，活體檢測(cè)，性能穩(wěn)定，滯留持久，熒光清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2^-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HOCl）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯（6-chloromethyl-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester；CM－H2DCFDA）是取代二氯二氫熒光素二乙酯（2´,7´-dichlorodihydrofluorescin diacetate；DCFH-DA）的升級(jí)產(chǎn)品，一種*自由通過細(xì)胞膜，并在細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期滯留而不易外漏的染色劑。一旦被過氧化氫、羥自由基或氫氧基、過氧化基、次氯酸等氧化，便產(chǎn)生熒光。據(jù)此測(cè)定組織細(xì)胞內(nèi)活性氧族的濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 100毫升

 固著液（Reagent B）  50毫升

 離析液（Reagent C）  20毫升

 染色液（Reagent D） 100微升

產(chǎn)品說明書   1份

保存方式

保存 染色液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 固著液（Reagent B）和 離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全；有效保證6月

用戶自備

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（GMS12024）：用于細(xì)胞脫離

*細(xì)胞培養(yǎng)液（GMS12052）：用于細(xì)胞操作所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于染色液配制的容器

2毫升離心管：用于樣品操作的容器

載玻片：用于組織染色操作

解剖針：用于植物組織解剖

血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀：用于細(xì)胞計(jì)數(shù)

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

培養(yǎng)箱：用于染色孵育

比色皿或黑色96孔板：用于熒光定量分析的容器

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光分析

細(xì)胞流式儀：用于細(xì)胞染色分析

熒光分光光度儀或熒光酶標(biāo)儀：用于熒光定量分析

實(shí)驗(yàn)步驟

方法一：活體組織染色

• 加上100微升 清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進(jìn)載玻片上的 清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上5微升 染色液（Reagent D） 
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm——綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高 

方法二：組織固定染色

• 加上100微升 清理液（Reagent A）在載玻片上
• 切取新鮮植物根尖，放進(jìn)載玻片上的 清理液（Reagent A）中
• 用解剖針小心壓碎根尖
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上2毫升 固著液（Reagent B）
• 室溫下，孵育3小時(shí)，避免干化
• 小心移去 固著液（Reagent B）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上1毫升 離析液（Reagent C）
• 室溫下孵育5分鐘
• 小心移去 離析液（Reagent C）
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）

• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）在根尖上
• 再加上5微升 染色液（Reagent D） 
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 取出載玻片，移去染色液
• 小心加上1毫升 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片，用拇指小心且垂直加壓
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm——綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

方法三、培養(yǎng)植物細(xì)胞脫離染色

• 準(zhǔn)備1瓶25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的待測(cè)細(xì)胞
• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 加入3毫升  清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 小心抽去 清理液（Reagent A）
• 加入1毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)培養(yǎng)平面
• 置入37℃培養(yǎng)箱1分種
• 振動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 加入4毫升用戶自備的*細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入15毫升錐形離心管，充分混勻（注意：懸浮細(xì)胞直接從這一步驟開始）
• 移取10微升在血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)
• 移出1 X 10⁶細(xì)胞到新的15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A）
• 再加入5微升 染色液（Reagent D），混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入預(yù)冷的400微升 清理液（Reagent A），輕柔混勻細(xì)胞顆粒群
• 放進(jìn)冰槽里
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：
  • 即刻進(jìn)行細(xì)胞流式儀分析：波長(zhǎng)488nm氬離子激光，觀察50000個(gè)細(xì)胞以上――

波峰右移，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用（共聚焦）熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

1）移取10微升上述細(xì)胞懸液到載波片上，蓋上蓋玻片

2）激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

• 或使用熒光分光光度儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

1）移取400微升上述細(xì)胞懸液到1毫升比色皿

2）加入600微升 清理液（Reagent A）

3）上下傾倒混勻數(shù)次

4）放進(jìn)熒光分光光度儀：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――

RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

方法四、貼壁培養(yǎng)細(xì)胞染色

• 準(zhǔn)備1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24孔板的待測(cè)細(xì)胞，細(xì)胞鋪滿率達(dá)70％

（注意：可以使用載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和其它培養(yǎng)孔板，見注意事項(xiàng)4）

• 小心抽去細(xì)胞培養(yǎng)液
• 小心沿著孔壁加入500微升 清理液（Reagent A）到1個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔，覆蓋培養(yǎng)孔表面
• 再加入2.5微升 染色液（Reagent D）
• 放進(jìn)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱里孵育20分鐘
• 小心抽去染色液 
• 小心沿著孔壁加入500微升37℃預(yù)熱的 清理液（Reagent A）到細(xì)胞培養(yǎng)孔
• 選擇下列方式之一進(jìn)行操作：

（A） 使用倒置熒光顯微鏡觀察（定性檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――綠色熒光增強(qiáng)，表明活性氧族（ROS）含量高

•  使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)（定量檢測(cè)）：

激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm――RFU增高，表明活性氧族（ROS）含量高

方法五、組織勻漿定量檢測(cè)

• 準(zhǔn)備好新鮮的植物組織（葉片、谷粒、種子等），并秤重以確定100毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入2毫升 清理液（Reagent A）清洗1次
• 即刻用刀片切碎組織
• 放進(jìn)一個(gè)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的2毫升 清理液（Reagent A）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器，在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入2毫升離心管，放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移出上清液（注意：不要觸碰沉淀物）到另一個(gè)新的預(yù)冷的2毫升離心管
• （選擇步驟）如果上清液含有肉眼可見的殘?jiān)?，重?fù)離心5分鐘一次，速度為5000g（或7500RPM，例如eppendorf 5415）
• （選擇步驟）即刻移入到2毫升離心管
• 移取5微升組織勻漿物進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒（GMS30030.1）
• 移取50微升組織勻漿物（樣品：100微克蛋白）或50微升 清理液（Reagent A）（背景對(duì)照）到1毫升比色杯里
• 加入950微升 清理液（Reagent A）
• 再加上5微升 染色液（Reagent D）
• 上下傾倒混勻
• 放進(jìn)37℃恒溫水槽孵育20分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光分光光度儀檢測(cè)：激發(fā)波長(zhǎng)490nm，散發(fā)波長(zhǎng)530nm——（樣品RFU-背景對(duì)照RFU）＝實(shí)際RFU：增加，表明活性氧族（ROS）含量高

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
•  固著液（Reagent B）和 離析液（Reagent C）具有腐蝕性，注意操作安全
• 孵育時(shí)，必須避免光照
• 建議染色完成后，即刻進(jìn)行熒光檢測(cè)分析
• 本產(chǎn)品適合各種規(guī)格的培養(yǎng)細(xì)胞：載玻片，載玻片培養(yǎng)皿，35mm培養(yǎng)皿，和各種培養(yǎng)孔板，須相應(yīng)調(diào)整操作用量：

• 本產(chǎn)品適合活體染色和固定染色，染色劑不易洗掉，染色持久
• 根據(jù)不同組織類型，調(diào)整 染色液（Reagent D）的使用劑量（1：100至1：1000容量比），避免過度染色
• 本公司提供系列活性氧分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定熒光清晰