細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑是一種旨在通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子特異性熒光探針Mag-Fluo-AM，與鈣離子結(jié)合后，其熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在熒光酶標(biāo)儀下觀察相對熒光峰值的變化，來測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中總鈣離子濃度的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種活體細(xì)胞（動(dòng)物、人體等）內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。在細(xì)胞內(nèi)，鈣離子主要儲(chǔ)存在線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器中。其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子儲(chǔ)存在控制細(xì)胞活化、調(diào)控信號(hào)通路、蛋白分子轉(zhuǎn)錄后修飾，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子平衡方面起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求，以及需要內(nèi)質(zhì)網(wǎng)純化。Mag-Fluo-AM染料是一種鈣離子低親和性的熒光標(biāo)記染料，特異性地由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)捕獲，可以檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的游離鈣離子濃度的變化。在熒光酶標(biāo)儀下，激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm，來定量測定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣濃度。

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A）      40毫升

 染色液（Reagent B） 30微升

 介導(dǎo)液（Reagent C）     600微升

 通透液（Reagent D）     120微升

 飽和液（Reagent E）       2毫升

 陰性液（Reagent F）       2毫升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存 清理液（Reagent A）、 染色液（Reagent B）、 介導(dǎo)液（Reagent C）和 通透液（Reagent D）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于工作液配制的容器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：用于染色孵育

黑色96孔板：用于樣品操作的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

（共聚焦）熒光顯微鏡：用于熒光染色觀察

實(shí)驗(yàn)步驟

• 測定準(zhǔn)備

• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（22℃）：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm
• 測定開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent B）室溫下融化，然后分別移出30微升 介導(dǎo)液（Reagent C）和1.5微升 染色液（Reagent B）到新的1.5毫升離心管，標(biāo)記為 染色工作液，并放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作。 

二、熒光酶標(biāo)儀檢測

• 準(zhǔn)備1個(gè)黑色96孔板，標(biāo)記為：細(xì)胞樣品孔、空白對照孔（不含細(xì)胞）、zui大對照孔（含細(xì)胞）
• 小心抽去細(xì)胞樣品孔的培養(yǎng)液
• 小心加入200微升  清理液（Reagent A） 
• 小心抽去清理液
• 小心加入100微升  清理液（Reagent A）
• 小心加入10微升 染色工作液
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心抽去染色液
• 加入200微升 清理液（Reagent A） 
• 加入2微升 通透液（Reagent D）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘（注意：這一步驟決定zui大內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池濃度讀數(shù)）
• 小心抽去含有 通透液（Reagent D）的清理液；同時(shí)抽去zui大對照孔（含細(xì)胞）的培養(yǎng)液
• 加入100微升 清理液（Reagent A）到細(xì)胞樣品孔里
• 加入100微升 飽和液（Reagent E）到zui大對照孔里
• 加入100微升 陰性液（Reagent F）到空白對照孔里
• 分別加入10微升 染色工作液到zui大對照孔和空白對照孔里
• 輕輕搖動(dòng)黑色96孔板，混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀測讀：獲得相對熒光單位（relative fluorescence unit；RFU） 
• 計(jì)算樣品內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子濃度

【（樣品RFU－空白對照孔R(shí)FU）÷（zui大對照孔R(shí)FU－樣品RFU）】X 22（微摩爾；解離常數(shù)）

三、（共聚焦）或熒光顯微鏡檢測

1． 準(zhǔn)備1個(gè)待測的細(xì)胞爬片樣品

• 小心加上500微升 清理液（Reagent A），覆蓋樣品表面
• 小心移去樣品上的 清理液（Reagent A）
• 移取300微升 清理液（Reagent A）到新的1.5毫升離心管
• 加入30微升 染色工作液，混勻 
• 小心加上上述 染色工作液到樣品上，覆蓋樣品表面
• 室溫下孵育60分鐘，避免光照
• 小心移去染色液
• 小心加上200微升 清理液（Reagent A） 
• 小心加上2微升 通透液（Reagent D）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱，孵育4分鐘
• 小心移去通透液
• 小心加上500微升新鮮的 清理液（Reagent A）
• 小心移去 清理液（Reagent A）
• 小心加上100微升新鮮的 清理液（Reagent A）
• 蓋上蓋玻片
• 即刻在（共聚焦）熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察：激發(fā)波長490nm，散發(fā)波長525nm（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子呈現(xiàn)綠色）

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次操作
• 操作時(shí)，須戴手套
• 避免使用EDTA等處理樣品
• 孵育反應(yīng)完成后即刻進(jìn)行熒光測定
• 如果待測樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 檢測敏感度可達(dá)納摩爾級(jí)鈣濃度范圍
• 如果熒光淬滅敏感，建議使用 抗淬滅劑I-GMS12058.2）
• 可以使用熒光分光光度儀檢測
• 本公司提供系列鈣生化檢測試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測敏感