細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶13活性熒光定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

 細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13）活性熒光定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過熒光探針MCA供體和DAP/DNP受體雙重標(biāo)記的多肽底物PChaGNvaHA，受到MMP13蛋白酶的水解，解離抑制基團(tuán)，產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，即采用熒光法來測(cè)定樣品中酶活性的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解萃取液樣品（動(dòng)物、人體）、部分或*純化酶樣品中基質(zhì)金屬蛋白酶13的特異活性定量檢測(cè)，以及抑制劑和激活劑的篩選。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，安全可靠。

技術(shù)背景

基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一類結(jié)構(gòu)高度同源的分泌型或膜相關(guān)性鋅內(nèi)肽酶的總稱，因含有金屬（鋅、鈣）離子而得名。其功能在于分解細(xì)胞外基質(zhì)成分。迄今為止發(fā)現(xiàn)的MMPs至少有28種，幾乎能降解除多糖以外的全部細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix）成分，同時(shí)參與胚胎發(fā)育、形態(tài)形成、胚泡植入（blastocyst）、血管形成、組織再吸收（tissue resorption）、疾病發(fā)生，例如關(guān)節(jié)炎、癌細(xì)胞浸入轉(zhuǎn)移等。根據(jù)降解的底物不同可將MMPs分為4大類：（1）膠原酶：MMP1、MMP8、MMP13主要消化Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和蛋白多糖；（2）明膠酶（Ⅳ型膠原酶）：MMP2、MMP9，又稱明膠酶A、B，主要消化Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原和彈性纖維；（3）基質(zhì)溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11、MMP12，主要作用于纖維粘連蛋白、層粘連蛋白、彈力纖維、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ膠原及MMP1、MMP8、MMP9；（4）膜型金屬蛋白酶：MT₁-MMP、MT₂-MMP、MT₃-MMP，主要作用于明膠、Ⅳ型膠原、MMP2。體內(nèi)絕大多數(shù)細(xì)胞并不儲(chǔ)備MMPs，當(dāng)需要MMPs的信號(hào)傳遞到細(xì)胞后才臨時(shí)合成，合成的MMPs以無(wú)活性的酶原（proenzyme）形式分泌到細(xì)胞外，隨后被多種蛋白酶和非蛋白酶水解以及熱處理激活，一種激活的MMPs可激活另一種MMPs，形成瀑布效應(yīng)。基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP13），又稱為膠原酶3（collagenase 3），其目標(biāo)蛋白是膠原蛋白（collagen）、明膠蛋白（gelatin）、纖維蛋白溶酶原（plasminogen）、聚糖（aggracan）和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（CXCL12）等。MMP13與腫瘤和關(guān)節(jié)炎等發(fā)生有關(guān)。MMP13酶原型為60kD，而活化型為48kD和更小分子。基于多肽底物PChaGNvaHA兩端標(biāo)記的供體熒光探針7-甲氧基香豆素（7-methoxycourmarin）受到另一個(gè)受體基團(tuán)二硝基苯二氨基異丁酰[N-3-（2,4-dinitrophenyl）-L-α-β-diaminopropionyl；Dap]的抑制而熒光淬滅（quench）。一旦多肽的Gly-Nva鍵受到MMP13水解，釋放出具有強(qiáng)烈熒光的7-甲氧基香豆素多肽片段，據(jù)此根據(jù)其熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)330nm，散發(fā)波長(zhǎng)400nm）的變化，來定量測(cè)定基質(zhì)金屬蛋白酶13的特異活性。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

 清理液（Reagent A） 毫升

 裂解液（Reagent B） 毫升

 緩沖液（Reagent C） 毫升

 底物液（Reagent D） 微升

 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）      微升

產(chǎn)品說明書 1份

保存方式

保存 底物液（Reagent D）和 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）在-20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent D）避免光照，有效保證3月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

培養(yǎng)箱：用于反應(yīng)孵育

黑色酶標(biāo)板：用于熒光分析的容器

熒光酶標(biāo)儀：用于熒光分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑置入冰槽里融化。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心加入xx毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升 清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx微升 裂解液（Reagent B），充分混勻
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 置于冰槽里孵育30分鐘
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用  Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

• 測(cè)定準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好待測(cè)樣品（例如細(xì)胞裂解萃取液或純化酶樣品等），置于冰槽里
• 設(shè)定好熒光酶標(biāo)儀（溫度為37℃）：激發(fā)波長(zhǎng)330nm，散發(fā)波長(zhǎng)400nm，間隔5分鐘，讀數(shù)6次（共30分鐘）
•  緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

• 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入xx微升 緩沖液（Reagent C）到1至5號(hào)管
• 移取xx微升 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到1號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升1號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的 標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

四、熒光測(cè)定

• 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品活性
• 分別移取xx微升 緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔中
• 分別加入20微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液或待測(cè)樣品（20微克純化酶或100微克細(xì)胞裂解萃取液蛋白）（注意：樣品須清澈）
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱里孵育10分鐘
• 分別加入xx微升 底物液（Reagent D）
• 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板
• 即刻放進(jìn)熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得相對(duì)熒光讀數(shù)RFU（Relative Fluorescence Unit）
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為相對(duì)熒光單位RFU；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)甲氧基香豆素多肽濃度（微摩爾/升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品活性對(duì)應(yīng)甲氧基香豆素多肽濃度（微摩爾/升）

五、計(jì)算樣品活性

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)液
• 操作時(shí)，須戴手套
• 系統(tǒng)操作過程中，標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定只需1次
• 樣品須澄清，至關(guān)重要
• 樣品準(zhǔn)備要點(diǎn)如下：
  • 樣品中避免使用EDTA、EGTA等二價(jià)陽(yáng)離子鰲和劑
  • 樣品中避免使用硫醇抑制劑（THIOL INHIBITOR）
  • 如果樣品中的基質(zhì)金屬蛋白酶活性很低，可以使用活化劑（建議使用 膠原酶潛酶活化劑（APMA）－GMS12197）
• 如果用戶沒有特定的濾波器，可以使用激發(fā)波長(zhǎng)320至340nm之間的任一波長(zhǎng)，散發(fā)波長(zhǎng)390至420nm之間的任一波長(zhǎng)
• 待測(cè)樣本為酶粗提樣品，其蛋白濃度為20微克/20微升；待測(cè)樣本為總蛋白，其蛋白濃度為100微克/20微升（本公司提供   Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒GMS30030.1）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度
• 可以使用基質(zhì)金屬蛋白酶13抑制劑CL-82198作為抑制劑對(duì)照或陰性對(duì)照
• 基質(zhì)金屬蛋白酶13活性單位濃度定義：在37℃溫度下，pH 7.5的情況下，每單位酶在單位時(shí)間內(nèi)（每分鐘）水解1納摩爾的多肽底物PChaGNvaHA
• 本公司提供系列基質(zhì)金屬蛋白酶檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感