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無(wú)論使用哪種固定方法，抗體結(jié)合及檢測(cè)的步驟基本相同。其方法學(xué)及理論與其他組織來(lái)源的染色均相似。在鑒定和證實(shí)陽(yáng)性反應(yīng)方面應(yīng)注意交叉反應(yīng)。在前述組織切片染色部分已討論關(guān)于抗體選擇和對(duì)抗原正確定位的方法。對(duì)于在蟲體中進(jìn)行抗原免疫定位的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是可檢測(cè)一個(gè)無(wú)效基因。如果可能的話，它對(duì)某些動(dòng)物染色是非常有用的，這些動(dòng)物可以攜帶一個(gè)突變基因或用RNAi處理過(guò)的，以抑制所研究抗原的合成。這樣會(huì)提供一個(gè)有用的對(duì)照，從而證實(shí)一種染色模式。顯然，在某些情況下，如基因功能的缺失是致命的，這種對(duì)照將是不可能的。
對(duì)于蟲體免疫染色來(lái)說(shuō)，zui常用的方法是應(yīng)用熒光染料標(biāo)記的試劑。在對(duì)蟲體的抗原進(jìn)行研究中常常不使用酶標(biāo)的二級(jí)試劑。其原因主要在于熒光染料對(duì)于抗原定位具有高度分辨力。
1．背景問(wèn)題
影響蟲體染色的一個(gè)重要因素是由于特異性和非特異性的交叉反應(yīng)所造成的較高背景。除了在檢測(cè)復(fù)雜組織的抗原時(shí)所遇到的問(wèn)題外，蟲體染色尚有一些特殊的問(wèn)題。
*個(gè)問(wèn)題是通過(guò)強(qiáng)烈固定和透化處理方法可破壞許多抗原表位，增加了交叉反應(yīng)發(fā)生的可能性。故需要使用多種抗體，并從中發(fā)現(xiàn)一種于所檢測(cè)抗原的抗體。
蟲體免疫染色所涉及的另一問(wèn)題是多克隆抗體的使用。多克隆抗血清幾乎均含有抗細(xì)菌的抗體，這些細(xì)菌存在于產(chǎn)生抗體的宿主動(dòng)物體內(nèi)。通常存在于腸道和皮膚，或在抗感染過(guò)程中形成。因?yàn)橄x體通常以細(xì)菌，如大腸埃希菌為食，這些抗體會(huì)混淆染色模式。如有可能，應(yīng)使用單克隆抗體以代替多克隆抗體。如果使用多克隆抗體，可以采用兩種策略：①所需的抗體可以通過(guò)抗原親和柱純化；②不是所需的抗體可以通過(guò)使用丙酮干燥臟粉預(yù)吸收去除。
2．蟲體的復(fù)染
在應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)蟲體，復(fù)染是必要的。復(fù)染還可用以鑒定抗原在細(xì)胞中的確切位置?？刹捎脙煞N通常的方法：①使用一種對(duì)核酸特異的熒光染料標(biāo)記所有的細(xì)胞，通常DAPI適用于落射式熒光顯微鏡，碘化丙酮（P1）適用于共聚焦顯微鏡。將這些染料加到洗滌緩沖液中即可；②利用受組織特異啟動(dòng)子驅(qū)使的GFP。將這些基因插入到表達(dá)載體中，通過(guò)其表達(dá)來(lái)鑒定細(xì)胞。正常情況下使用GFP表達(dá)，或者使用GFP抗體（可購(gòu)買）。
3．對(duì)照
特異性染色反應(yīng)需要與對(duì)照進(jìn)行比較。為了準(zhǔn)確評(píng)價(jià)染色模式，應(yīng)對(duì)來(lái)自同一種屬的兩種抗體進(jìn)行比較。對(duì)于多克隆抗體，的對(duì)照是事先從制備特異性抗體的同一動(dòng)物免疫前采集的血清，但也可以使用來(lái)自相同種屬的非免疫動(dòng)物的血清。對(duì)于單克隆抗體而言，對(duì)照應(yīng)該與特異性抗體的來(lái)源相同；例如，細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)比上清，小鼠腹水對(duì)比腹水，純化抗體對(duì)比純化抗體。對(duì)照抗體應(yīng)該與特異性抗體的類和亞類相同。來(lái)自親代骨髓瘤的細(xì)胞培養(yǎng)上清不適合作為對(duì)照，因?yàn)槠渲胁⒉话贵w。適宜的對(duì)照雜交瘤細(xì)胞株可從ATCC或歐洲動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心獲得。此外，應(yīng)該檢測(cè)二級(jí)試劑。在可能的情況下，同時(shí)對(duì)攜帶所研究抗原基因缺失的蟲體進(jìn)行染色。這將為特異性抗體提供一個(gè)*的遺傳對(duì)照。
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