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1）在細(xì)胞染色之前，制備溶于蒸餾水的lmg／m1多聚賴氨酸溶液（平均分子質(zhì)量400kDa）。將多聚賴氨酸涂于載玻片上，孵育15min。用水沖洗玻片，干燥后將玻片保存在室溫。
（2）建立對數(shù)生長期的酵母菌細(xì)胞。取出生長培養(yǎng)的樣品。
（3）加入5倍體積的新鮮配制的4％多聚甲醛（見附錄Ⅳ，但不溶于PBS中而用0．1mol／L磷酸鉀溶解，pH6．5）。
（4）混均后于室溫下孵育90min。
（5）用0．1mol／L磷酸鉀（pH6．5）洗細(xì)胞3次。
（6）zui后將沉淀重懸于1．2m01／L、0．12mol／L磷酸鉀和33mm01／L檸檬酸（pH5．9）中。
（7）加1／10體積p—葡萄糖醛酸酶（原液來自Helix pomatia，終濃度約為10 000U／m1）和1／100體積的酵母菌裂解酶（或溶細(xì)胞酶，終濃度為50U／m1），以消化細(xì)胞壁。于30℃下孵育90min。
葡萄糖醛酸酶去除細(xì)胞壁的時間長短依賴于該酶的不同批號，在某些情況下也依賴于不同的染色方法或酵母菌的種類。
（8）用山梨醇緩沖液洗細(xì)胞3次。
（9）將細(xì)胞懸液加到涂有多聚賴氨酸的載玻片或蓋玻片上，于室溫下孵育15min。
（10）將玻片浸入甲醇中， —20℃6min。
（11）將玻片轉(zhuǎn)置丙酮中， —20℃30s。
（12）在含1％BSA的PBS中漂洗玻片5min。
（13）在含1％羊IgG的PBS中孵育玻片1h。
在此方法中，來自非免疫動物的羊IgG用作封閉劑?？梢詮恼Ｑ蜓逯型ㄟ^蛋白G純化而獲得。該封閉試劑是有選擇的，因本文推薦的標(biāo)記二級試劑是羊抗鼠（或兔）免疫球蛋白抗體。如果使用的是其他來源的標(biāo)記二級試劑，應(yīng)改變封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。
（14）用PBS洗玻片一次。
（15）將蓋玻片、載玻片或平皿放置在乎面上。
（16）加足量的一抗覆蓋所需的面積。通常體積
單克隆抗體通常從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中獲得（特異性抗體濃度為20—50vg／m1）。小鼠腹水、純化的單克隆和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應(yīng)該測試其稀釋度。如果特異性抗體的濃度是未知的，制備并測試初始制品的不同稀釋度（1：10，1：100，1：1 000，1：10 000）。
（17）將蓋玻片、載玻片或平皿在室溫下至少孵育30min。若孵育的時間<1h，則不需要保持濕度，可將玻片放置在桌面上。對于某些抗原抗體反應(yīng)，孵育時間延長達(dá)12h可增加反應(yīng)的靈敏度。但一定不能讓樣品干燥，簡單的辦法是放一片封口膜在樣品上。較長時間的反應(yīng)應(yīng)降低*抗體的濃度。
（18）用PBS洗3次，每次5min以上。
PBS緩沖液中可以含1％TritonX-100或NP-40，以幫助解決背景問題。
（19）加入熒光素標(biāo)記的抗Ig抗體。這些試劑可從商品試劑公司購置。應(yīng)確認(rèn)所選擇的第二抗體對于一抗是特異性的。例如，如果*抗體是由兔所產(chǎn)生的，則應(yīng)選擇羊抗兔Ig。第二抗體應(yīng)該用含蛋白質(zhì)的溶液如1％羊IgG進(jìn)行稀釋。試劑提供者可建議適合的稀釋度，但如果沒有提供有關(guān)信息，可進(jìn)行二抗稀釋度測定，稀釋度范圍在1：10和1：1000之間。
（20）加入標(biāo)記的二抗試劑后在室溫下孵育至少20rain，但不應(yīng)超過1h。
（21）用PBS洗3次，每次5min以上。
（22）用Gelvatol或Mowiol封片。在熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡下觀察并照相。
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