1.適用范圍

　　本方法適用于出口茶葉中Aflatoxin B1含量的檢驗(yàn)。

　　2.原理概要

　　樣品用CHCl3提取，提取液經(jīng)硅膠柱凈化，凈化后的提取液用三C2HF3O2衍生，用配有熒光檢測器的液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。

　　3.主要試劑和儀器

　　3.1.主要試劑：CHCl3、正己烷、苯、甲醇：紫外光譜級、乙腈：紫外光譜級、三C2HF3O2、乙腈-水溶液(1+1)、CHCl3-甲醇溶液(95+5)、苯-乙腈溶液(98+2)、Aflatoxin B1標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%、Aflatoxin B1標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取適量的Aflatoxin B1標(biāo)準(zhǔn)品，以苯-乙腈溶液于棕色容量瓶中，配成濃度為10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液。根據(jù)需要，再配成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

　　3.2.儀器

　　液相色譜儀，配有熒光檢測器;

　　硅膠小柱：Sep-pak Silica前處理小柱或相當(dāng)?shù)墓枘z前處理小柱;

　　振蕩器;

　　旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，配有100mL具尾管的圓底燒瓶;

　　微量注射器;

　　離心管：5mL具塞磨口;

　　粉碎機(jī);

　　濾膜：有機(jī)系用，0.45μm;

　　微孔濾膜過濾器：有機(jī)系用，0.5μm。

　　4.試樣的抽取與制備

　　4.1.檢驗(yàn)批

　　以不超過2000件為一檢驗(yàn)批。

　　同一檢驗(yàn)批的商品應(yīng)具有相同的特征，如包裝、標(biāo)記、產(chǎn)地、規(guī)格、等級等。

　　4.2.抽樣數(shù)量

　　批量，件 低抽樣數(shù)，件

　　1～5 1

　　6～50 2

　　51～500 11

　　501～1000 16

　　1001～1500 19

　　1501～2000 20

　　4.3.抽樣方法

　　從整批產(chǎn)品堆垛的上下不同部位隨機(jī)抽取2.2規(guī)定的件數(shù)，逐件開啟。分別倒出全部茶葉于塑料布上，用取樣鏟從每件中各取出有代表性的樣品約500g。將所取樣品充分混勻，用四分法或分樣器逐步縮分出500g，裝入潔凈密封的樣品筒內(nèi)，加封后，標(biāo)明標(biāo)記，及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室。

　　4.4.試樣制備

　　將所取回樣品全部磨碎，通過20目篩，混勻，均分成兩份試樣，裝入潔凈容器內(nèi)，密封，標(biāo)明標(biāo)記。

　　4.5.試樣保存

　　將試樣于室溫下保存。

　　注：在抽樣和制樣的操作過程中，必須防止樣品受到污染或發(fā)生殘留物含量的變化。

　　5.過程簡述

　　5.1.提取

　　稱取試樣5.0g(到0.1g)置于100mL具塞錐形燒瓶中，加入15mLCHCl3，于振蕩器上提取30min，然后經(jīng)墊有玻璃纖維的漏斗過濾。收集濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的具尾管圓底燒瓶內(nèi)，并用CHCl3洗滌濾渣，收集濾液至約20mL。

　　5.2.凈化

　　用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上述濾液在50℃水浴中濃縮至約1mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后，注入硅膠小柱中。用2～4mL正己烷洗滌燒瓶后淋洗小柱，棄去流出液。然后用3～4mLCHCl3-甲醇溶液以每秒鐘2滴的流速洗脫，收集洗脫液于離心管中。用氮?dú)饩従彺蹈?，供衍生用?/p>

　　5.3.衍生

　　5.3.1.試樣

　　加200μL正己烷和50μL三C2HF3O2于上述離心管中，蓋緊磨口塞，超聲振蕩1min，靜置10min，打開磨口塞，緩緩?fù)ㄈ氲獨(dú)庵粮?。用乙?水溶液(1+1)定容至1.0mL，超聲1min，用0.5μm濾膜過濾，濾液供液相色譜用。

　　5.3.2.標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

　　取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，用氮?dú)饩従彺蹈?，?.3.1步驟操作。

　　5.4.測定

　　5.4.1.色譜條件

　　色譜柱：NOVA PAKc18，300mm×3.9mm(內(nèi)徑);

　　流動相：甲醇-水溶液(42+58);

　　流速：0.8mL/min;

　　熒光檢測器：激發(fā)波長375 nm，發(fā)射波長425 nm;

　　色譜柱溫度：室溫。

　　5.4.2.測定

　　根據(jù)樣液中Aflatoxin B1的含量情況，選定峰高相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液中Aflatoxin B1衍生物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測線性范圍內(nèi)。對標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液的衍生物溶液等體積參**樣測定。在上述色譜條件下，Aflatoxin B1衍生物保留時(shí)間約為8min。

　　5.4.3.空白試驗(yàn)

　　除不加試樣外，按上述測定步驟進(jìn)行。

　　6.結(jié)果計(jì)算

　　用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或按下式計(jì)算試樣中Aflatoxin B1的含量：

　　X= A·cs

　　As·c

　　式中：X -- 試樣中Aflatoxin B1的含量，mg/kg;

　　A -- 樣液中Aflatoxin B1衍生物的峰面積，mm2;

　　cs -- 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中AflatoxinB1的濃度，μg/mL;

　　As -- 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中AflatoxinB1衍生物的峰面積，mm2;

　　c -- 終樣液所代表試樣的濃度，g/mL。

　　注：計(jì)算結(jié)果需扣除空白值。

　　7.低限和回收率測定

　　7.1.低限

　　本方法的測定低限為0.001mg/kg。

　　7.2.回收率

　　回收率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)：Aflatoxin B1的添加濃度在0.001～0.5mg/kg范圍內(nèi)，回收率為89.1%～104.9%。