實(shí)驗(yàn)試劑

細(xì)胞培養(yǎng)液成分為RPMI1640基本培養(yǎng)液 10%胎牛血清 1%三抗，PBS，凍存培養(yǎng)液(含10%DMSO或甘油)，Trypsine-EDTA消化液，液氮
實(shí)驗(yàn)設(shè)備

水浴鍋，35mm培養(yǎng)皿，37℃培養(yǎng)箱，無(wú)菌凍存管，低溫冰箱，超低溫冰箱
實(shí)驗(yàn)材料

已凍存的HEK293和HeLa細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 細(xì)胞的復(fù)蘇
    1) 保存細(xì)胞的冷凍管直接投入37℃溫水，不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化，解凍1分鐘；
    2) 取出冷凍管，用酒精消毒后打開(kāi)管蓋，吸出細(xì)胞懸液，注入離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混合后低速離心，除去上清液，再用培養(yǎng)液重復(fù)洗一次；
    3) 用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，接種35mm培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打混勻后，放在37℃的培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
2. 細(xì)胞的傳代(貼壁細(xì)胞的消化法)
    1) 吸出皿內(nèi)舊的培養(yǎng)基，加PBS于皿中，清洗兩次，用于洗去瓶?jī)?nèi)殘存的血清，以防止血清對(duì)胰蛋白酶活性的影響；
    2) 加0.2ml Trypsine-EDTA消化液輕輕搖動(dòng)，使消化液流遍所有細(xì)胞表面充分消化細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，立刻終止消化；
    3) 吸出消化液，再加培養(yǎng)液，反復(fù)吹打至沒(méi)有細(xì)胞團(tuán)。吹打動(dòng)作要輕柔，盡可能不要出現(xiàn)泡沫，這些都會(huì)對(duì)細(xì)胞有損傷。將細(xì)胞懸液接種到新的培養(yǎng)皿中。
3. 細(xì)胞的凍存
    1) 從增殖期到形成致密的單層細(xì)胞以前的培養(yǎng)細(xì)胞都可以用于凍存，是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，已經(jīng)長(zhǎng)滿的細(xì)胞凍存后生存率低。凍存前一天換一次培養(yǎng)液；
    2) 用Trypsin-EDTA把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則不需處理。依據(jù)傳代方法把消化好的細(xì)胞收集于離心管并計(jì)數(shù)離心；
    3) 去除Trypsin-EDTA，加入配制好的凍存培養(yǎng)液(含10%DMSO或甘油)，凍存液中細(xì)胞的終密度為106/ml-107/ml。用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，然后分裝入無(wú)菌凍存管，每個(gè)凍存管加液1-1.5ml。凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱；
    4) 把凍存管放入4℃冰箱30min；然后轉(zhuǎn)移至-20℃2h；隨后將凍存管轉(zhuǎn)移到-80℃過(guò)夜；第二天迅速浸入液氮中長(zhǎng)期保存。要適當(dāng)掌握降溫速度，過(guò)快會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)水分的滲出，太慢則促進(jìn)冰晶的形成。