一、原理與目的
多酚氧化酶是植物組織內(nèi)廣泛存在的一種含銅氧化酶，植物受到機(jī)械損傷和病菌侵染后，PPO催化酚與O2氧化形成醌，是組織形成褐變，以便損傷恢復(fù)，防止或減少感染，提高抗病能力。醌類物質(zhì)對(duì)微生物有毒害作用，所以傷口醌類物質(zhì)出現(xiàn)是植物防止傷口感染的愈傷反應(yīng)，因而受傷組織一般這種酶的活性就會(huì)提高。多酚氧化酶也可與細(xì)胞內(nèi)其他底物氧化相偶聯(lián)，起到末端氧化酶的作用。
PPO的存在是水果、蔬菜褐變及營(yíng)養(yǎng)喪失的主要原因之一。PPO氧化內(nèi)源的酚類物質(zhì)生成鄰醌，鄰醌再相互聚合成醌或蛋白質(zhì)、氨基酸等作用生成高分子絡(luò)合物而導(dǎo)致褐色素的生成，色素分子量愈高，顏色愈暗。多酚氧化酶活性高低也是馬鈴薯解除休眠的指標(biāo)之一。
本實(shí)驗(yàn)將采用馬鈴薯為主要材料，通過(guò)組織細(xì)胞破碎勻漿、過(guò)濾、離心、硫酸銨沉淀、透析等步驟獲得PPO的粗酶液。
通過(guò)本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)和了解蛋白質(zhì)的提取、分離的基本原理和方法，掌握相關(guān)儀器設(shè)備的操作使用，以及蛋白質(zhì)的提取、分離的系統(tǒng)技術(shù)。
二、材料與試劑
（1）馬鈴薯（大約每小組100-200g）
（2）試劑：
0.03M磷酸緩沖液PH6.0(內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%的聚乙烯吡咯烷酮)配制時(shí)配×10倍的濃縮液1000ml；固體硫酸銨；0.03M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，0.005MgCL2）配置時(shí)配
（3）實(shí)驗(yàn)器械與儀器設(shè)備：
試管與試管架；燒杯、玻璃攪棒；移液管、滴管等；試劑瓶；透析袋；
過(guò)濾紗布；植物組織勻漿器；pH計(jì)和pH試紙；GL-20C高速冷凍離心機(jī)；
DL-7A大容量低速冷凍離心機(jī)
三、操作步驟
1：粗酶提?。?br />水果肉組織按1：1（W/V）比例與003M磷酸緩沖液PH6.0（內(nèi)含0.02M巰基乙醇，0.001MEDTA，5%甘油，1%聚乙烯吡咯烷酮）混合，勻漿4層后紗布過(guò)濾，濾液以6000rpm離心10min，棄除沉淀獲得酶提取液。
2：鹽析分級(jí)沉淀：
在酶提取液中加入固體硫酸銨使其達(dá)到40%飽和度（邊加邊攪拌達(dá)到充分溶解），然后6000rpm離心20min棄除沉淀；離心上清液在加入固體硫酸銨達(dá)到70%飽和度（邊加邊攪拌達(dá)到充分溶解），再以6000rpm離心20min，棄除上清夜，收集粗酶沉淀。
四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
獲得PPO粗酶液。