NK細(xì)胞存在于人或動物外周血、脾臟、淋巴結(jié)和骨髓中，能殺傷某些腫瘤細(xì)胞、病毒感染靶細(xì)胞，無需抗原或有絲分裂原刺激，也不依賴抗體或補體，在機(jī)體殺傷腫瘤、防御感染及免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。LAK是NK或T細(xì)胞在體外高劑量IL-2誘導(dǎo)下，獲得能殺傷NK抵抗的腫瘤細(xì)胞的功能，在過繼免疫治療腫瘤中已得到廣泛的應(yīng)用。通過將同位素⁵¹Cr摻入到NK的靶細(xì)胞K562（紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞）或LAK的靶細(xì)胞Libr（黑色素瘤細(xì)胞），按一定細(xì)胞比例與效應(yīng)細(xì)胞（NK或LAK）孵育4小時，根據(jù)細(xì)胞上清中靶細(xì)胞被殺傷后所釋放的⁵¹Cr水平計算出殺傷細(xì)胞的殺傷活性。

細(xì)胞系

FCS RPMI 164051Cr

培養(yǎng)瓶培養(yǎng)板CO2孵箱離心機(jī)β-液閃儀γ-計數(shù)儀

1.  NK功能效應(yīng)細(xì)胞可取靜止的PBMC，或經(jīng)不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)的PBMC。

2.  LAK功能的效應(yīng)細(xì)胞通常將PBMC或腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞（TIL）或體液（癌性胸腺水）中分離的淋巴細(xì)胞（1×10⁶/ml）在含有高劑量IL-2（200~1000 ul/ml）的10%FCS RPMI 1640誘導(dǎo)2~5 d 而成。

二、殺傷試驗
 

  主要有⁵¹Cr 4 h 釋放法和³H-TdR釋放法，前者操作時間短，非常敏感；后者需要無菌操作，所需時間較長。

1.   ⁵¹Cr4h釋放試驗

（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞（K562、LiBr等），洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml

（2）取1×10⁶細(xì)胞（0.5 ml），加Na₂⁵¹CrO₄ 100 uCi，37度孵育2~3 h，每15 min 輕輕振搖一次。

（3）用10%FCS RPMI 1640洗滌3次，每次800 rpm、5 min。

（4）重懸細(xì)胞濃度1×10⁵/ml。

（5）96孔v型或U型培養(yǎng)板中，每孔加100 ul（1×104細(xì)胞），設(shè)3個復(fù)孔。

（6）每孔加入100 ul 不同細(xì)胞濃度的效應(yīng)細(xì)胞，大釋放組加入100 ul 1%Triton X-100；自然釋放組加100 ul *培養(yǎng)基。

（7）200g離心1 min。

（8）37度、CO₂孵箱培養(yǎng)4 h。

（9）200 g 離心1 min。

（10）每孔取出100 ul 上清，β計數(shù)儀測定值。

（11）計算：特異性殺傷率（%）=（實驗組cpm-自然釋放cpm）/（對照組-自然釋放cpm）

2.  ³H-TdR釋放試驗
 

（1）收獲處于對數(shù)生長期的靶細(xì)胞（K562、LiBr等），洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為2×10⁶/ml，加³H-TdR 20 uCi。

（2）7度孵育2~3 h。

（3）用10%FCS RPMI 1640洗滌3次，每次800 rpm、5 min，調(diào)整濃度為1×10⁵/ml。

（4）96孔U型或平底培養(yǎng)板中，每孔加100 ul（1×10⁴細(xì)胞），設(shè)3個復(fù)孔。

（5）每孔加入100 ul 不同細(xì)胞濃度的效應(yīng)細(xì)胞，大釋放組加入100 ul 1%Triton X-100；自然釋放組加100 ul *培養(yǎng)基。

（6）CO₂孵箱培養(yǎng)18~24 h。

（7）每孔取出100 ul 上清，加入胰蛋白酶（終濃度0.15%）和DNA酶（終濃度為0.0125%）

（8）繼續(xù)孵育30 min。

（9）用細(xì)胞收集儀收獲于玻璃纖維紙上。

（10）烤干后，β計數(shù)儀測定值。

（11）計算：特異性殺傷率（%）=（1-實驗組cpm/對照組cpm）×100%

1.  每次試驗取3~4個不同的效應(yīng)細(xì)胞/靶細(xì)胞比例，常用效靶比例為100：1、50：1、25：1、12.5：1。

2.  誘導(dǎo)LAK細(xì)胞過程中要注意無菌操作。

3.  避免同位素污染。

根據(jù)實驗需要，可采用純化的NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，常用Percoll不連續(xù)密度梯度離心純化NK細(xì)胞（見表）。
 

1個溶解單位（Lyticunit，LU）為一定效應(yīng)細(xì)胞30%溶解（殺傷）5×10³/靶細(xì)胞（K562）的水平。

如需進(jìn)一步純化LGL，可通過除去具有高親和性羊紅細(xì)胞受體細(xì)胞（T細(xì)胞），因為NK細(xì)胞只具有低親和性的綿羊紅細(xì)胞受體（ER）。具體方法是將Percoll分離的位于第2、3梯度間的細(xì)胞洗滌后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10⁶/ml，移入試管，加入2 ml FCS和2 ml 1×10⁸/mlSRBC，100 g 離心5 min，29度孵育1 h，輕輕重懸細(xì)胞，疊加于3 ml Ficoll上，400 ug 室溫下離心30 min，界面不形成花環(huán)的細(xì)胞即為LGL，純度可大于90%。

在用PBMC作為效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行NK活性測定時，如想除去PBMC懸液中混雜的紅細(xì)胞，可用蒸餾水低滲的方法除去紅細(xì)胞，而不用NH4Cl方法，因為后者可降低NK功能。

在小鼠NK實驗中必須注意小鼠的品系和周齡，三周內(nèi)或3月齡以上小鼠的NK水平一般很低。