球體是小型的3D細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，可以用于諸如低吸附微孔板等特殊的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。這種體外3D細(xì)胞培養(yǎng)模型具有高度的臨床及生物可靠性，并且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于高通量篩選(HTS)和細(xì)胞培養(yǎng)，從而方便對(duì)諸如化合物毒性和癌癥等重大疾病進(jìn)行研究。Multicellular tumor spheroids(MCTS)可以模擬腫瘤組織，因此其經(jīng)常被用來(lái)彌補(bǔ)傳統(tǒng)2D環(huán)境，如在微板上的單層細(xì)胞和動(dòng)物模型間的缺失。目前3D技術(shù)已經(jīng)被廣泛地接受作為更的模擬癌癥細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)狀態(tài)和有效評(píng)估新的抗癌策略的方法。

FUCCI(fluorescent ubiquitination-basedcell-cycle indicator)小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時(shí)期，因此可以用來(lái)研究癌癥細(xì)胞周期的進(jìn)程。FUCCI技術(shù)建立在鑒定過(guò)表達(dá)的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中g(shù)eminin融合的是綠色熒光基團(tuán)AmCyan，而Cdt1融合的是紅色熒光基團(tuán)mCherry。Cdt1和geminin的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動(dòng)：Cdt1蛋白水平在G1階段達(dá)到峰值，而geminin蛋白水平在S，G2和M期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達(dá)FUCCI細(xì)胞核在G1期為紅色而在S，G2和M期則呈現(xiàn)綠色(圖1)。

SpectraMax^®i3x多功能讀板機(jī)配置SpectraMax^®MiniMax^TM300細(xì)胞計(jì)數(shù)儀，具有transmittedlight(TL)，綠色(Ex/Em:460/541)和紅色(Ex/Em:625/713)熒光通道。MiniMax細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的SoftMax^®Pro軟件可以用來(lái)獲得各種細(xì)胞的圖像并進(jìn)行分析。本說(shuō)明旨在介紹如何利用MiniMax細(xì)胞計(jì)數(shù)儀快速地獲取及分析FUCCI小球的圖像。

優(yōu)勢(shì)

- 應(yīng)用細(xì)胞成像功能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程
- 多參數(shù)分析細(xì)胞球，操作簡(jiǎn)便
- SoftMax Pro 軟件可以靈活地自定義細(xì)胞球的分析方法，滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求

材料

- SpectraMax i3x 多功能讀板機(jī) (Molecular Devices cat. #i3x)
- SpectraMax MiniMax 300 細(xì)胞成像儀(Molecular Devices cat. #5024062)
- Corning 96-well 低吸附 U 底板 (Corning cat. #7007)
- A375S FUCCI 細(xì)胞 (Institute of CancerResearch 提供, London)
- DMEM / F12 培養(yǎng)基 (Invitrogen cat.#11320-033)
- EGF (Invitrogen cat. #PHG0311)
- B27 補(bǔ)充液 (Invitrogen cat #17504001)

方法

球體的制作和培養(yǎng)

Institute of CancerResearch(ICR)負(fù)責(zé)制造表達(dá)FUCCI報(bào)告系統(tǒng)mCherry-Cdt1和AmCyan-geminin的細(xì)胞，制作按照Dufau等人發(fā)表的流程進(jìn)行。A375S FUCCI球體準(zhǔn)備的方法如下：Corning公司96孔U型底低吸附細(xì)胞培養(yǎng)板中加入含有EGF(20ng/mL)和B27(1x)的DMEM/F12培養(yǎng)基，按每孔1,000細(xì)胞進(jìn)行種板。細(xì)胞板離心(800g，6min)后在37℃，5%CO₂條件下進(jìn)行孵育。后，用含10%FCS的培養(yǎng)基清洗球體3次以移除EGF和B27，繼續(xù)培養(yǎng)1至6天。

數(shù)據(jù)分析

MiniMax細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的透射光模塊可以從自動(dòng)聚焦得到*的圖像效果。SoftMax Pro軟件中的“Field Analysis”能進(jìn)行自定義分析從而鑒別細(xì)胞重疊的部分。我們應(yīng)用一種特殊的鑒別方法來(lái)區(qū)分目標(biāo)球體和其余物體，如殘?jiān)蛡€(gè)體細(xì)胞，從而在后續(xù)的分析中予以去除(Figure2,AandE)。后，我們選擇感興趣的區(qū)域并從圖像中去除不想要的物體。在綠色和紅色熒光通道中，球體可以通過(guò)“Object Count”模式中大小和與背景相對(duì)熒光強(qiáng)度的區(qū)別被輕易的篩選出來(lái)(Figure2,B-D,F-G)。然后運(yùn)用SoftMax Pro軟件計(jì)算圖像的“%Area coverage”和球體的“Object Area”(μm2)。圖像的獲取和分析的設(shè)置方法見(jiàn)表1。

結(jié)果

SoftMax Pro軟件中獲取及分析的設(shè)置可以在綠色和紅色熒光通道的透射光下簡(jiǎn)便快速的分辨每個(gè)孔中的單球體。SoftMax Pro軟件還可計(jì)算所有通道包含的面積占比和物體面積(μm2)(圖2，表2)。在綠色和紅色熒光通道下可以獲得*的結(jié)果。

對(duì)于FUCCI球體來(lái)說(shuō)，圖2中紅色部分展示的是光滑圓潤(rùn)的球體而綠色部分則在細(xì)胞表面，說(shuō)明球體內(nèi)部的細(xì)胞處在G1期而表面細(xì)胞即將進(jìn)入M期。

對(duì)應(yīng)軟件可以分辨球體大小和形狀(球形參數(shù))的各種變化，因此常用來(lái)研究多種處理，如抗癌藥物，對(duì)細(xì)胞增殖的影響(圖3)。MiniMax中綠色和紅色熒光的光學(xué)成形功能可以將3D圖像轉(zhuǎn)換為2D投射球體圖。

結(jié)論

MiniMax細(xì)胞計(jì)數(shù)儀配合SoftMax Pro軟件的整合數(shù)據(jù)分析可以獲取綠色和紅色熒光通道及透射光下FUCCI球體的圖像并進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)者可以用多種方法對(duì)球體進(jìn)行評(píng)估，包括圖像覆蓋的區(qū)域，目標(biāo)物大小、形狀，從而為實(shí)驗(yàn)者提供了多參數(shù)全景的細(xì)胞數(shù)據(jù)分析。SpectraMax i3x多功能讀板機(jī)搭配MiniMax細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的將成像的優(yōu)勢(shì)和讀板機(jī)的簡(jiǎn)便結(jié)合在一起。通過(guò)簡(jiǎn)化的數(shù)據(jù)采集和分析流程，SoftMax Pro軟件提供了FUCCI球體分析的完整解決方法。

文獻(xiàn)