胚胎的形成是一個(gè)機(jī)體高度協(xié)調(diào)配合的過程，其分化過程被嚴(yán)格控制，但具體的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。胚胎干細(xì)胞是分離自著床前胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞系，在體外特定條件下可長(zhǎng)期培養(yǎng)，具有分化性，是體外研究細(xì)胞分化過程的合適選擇。



環(huán)磷酸腺苷 (cAMP, cyclic adenosine monophosphate)-環(huán)磷酸腺苷依賴的蛋白激酶 A(PKA, protein kinase A) 信號(hào)通路分布于多種細(xì)胞中，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化 (如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓干細(xì)胞等)。cAMP 為經(jīng)典的信號(hào)通路是通過激活 PKA 實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞功能的調(diào)控，細(xì)胞受到外界刺激時(shí)如受到腎   上腺素刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi) cAMP 濃度上升，隨后細(xì)胞內(nèi)四分子的 cAMP 分別與 PKA 的兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基結(jié)合。PKA 結(jié)合 cAMP 后，其調(diào)節(jié)亞基和催化亞基解離，游離的兩個(gè)催化亞基進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)作用于下游信號(hào)分子如 CREB 等，參與目的基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮其對(duì)細(xì)胞增殖、分化與凋亡等的調(diào)節(jié)作用。



cAMP-PKA 信號(hào)通路在細(xì)胞脅迫、再生過程中具有重要作用。本文通過對(duì)胚胎細(xì)胞早期分化標(biāo)志物的檢測(cè)，研究了 PKA 激活及下游的 G9a（EHMT2）甲基化酶在胚胎細(xì)胞早期分化過程中的重要調(diào)節(jié)作用。

本研究中檢測(cè)內(nèi)胚層和外胚層標(biāo)志物 Foxa2 和 Nestin 的抗體來自 Bioss（Anti-Foxa2, bs-2358R；Anti-Nestin, bs-008R）。

日本京都大學(xué)干細(xì)胞分化團(tuán)隊(duì) Kohei Yamamizu 等以 PKA 為著手點(diǎn)，利用小鼠胚胎干細(xì)胞（ESCs）為模型，分析了 cAMP/PKA 信號(hào)通路對(duì)胚胎干細(xì)胞分化的作用及相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。首先，證明了胞內(nèi) cAMP 濃度的升高是促使 ESCs 分化的必須條件（Fig1A），通過檢測(cè)發(fā)現(xiàn) CA-PKA 細(xì)胞模型（DoX-，PKA 激活模型，F(xiàn)ig1B）在 D1.5 即有 FlK+ 、PDGFRα+中胚層細(xì)胞和 Brachyury+中內(nèi)胚層細(xì)胞生成，與此同時(shí) SSEA1+（未分化 ESCs 標(biāo)志）細(xì)胞比例卻明顯下降（Fig1C-I），由此可知 PKA 可以在 ESC 分化早期促使 ESC 向中胚層細(xì)胞轉(zhuǎn)變。
   




Fig 1. PKA Accelerates Differentiation Timing of Mesodermal Cells from ESCs

在 PKA 激活狀態(tài)下，內(nèi)胚層標(biāo)志細(xì)胞 Foxa2+（Anti-Foxa2, bs-2358R, Bioss）和 Sox17+在 D1.5 出現(xiàn)，在隨后的 2 天中持續(xù)增多（Fig2A-D）；外胚層標(biāo)記細(xì)胞 Nestin+（Anti-Nestin, bs-008R, Bioss）所占比例也自 D1.5 開始呈直線上升趨勢(shì)（Fig2 G-I）。綜上可知，PKA 可以加速小鼠 ESCs 向三胚層細(xì)胞的分化。



Fig 2. PKA Accelerates Differentiation Timing of Endodermaland Ectodermal Cells from ESCs

在 ESCs 分化過程中，PKA 與多種基因表達(dá)有關(guān)，據(jù)此推測(cè) PKA 下游信號(hào)通路可能會(huì)涉及到基因的遺傳性修飾。表觀遺傳因素在細(xì)胞型和分化相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控中起著重要作用，其中組蛋白甲基化和 DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)的主要機(jī)制，參與了異染色質(zhì)形成、基因印記、基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等過程。在本研究中 H3K9me2 在眾多組蛋白 H3 甲基化蛋白中表達(dá)水平明顯增多（Fig3A）。

G9a 是一種具有經(jīng)典 SET 結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，主要負(fù)責(zé)常染色質(zhì)區(qū)域組蛋白 H3 中 K9 位點(diǎn)的甲基化，可以促進(jìn)基因啟動(dòng)子區(qū)域組蛋白或 DNA 的甲基化，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄，其在哺乳動(dòng)物的胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過程中起著*的作用。本研究中發(fā)現(xiàn)在 PKA 激活狀態(tài)下，G9a 蛋白表達(dá)水平在細(xì)胞分化早期就明顯增多，且表達(dá)增多節(jié)點(diǎn)先于 H3K9me2（Fig3B-C）。


Fig 3. PKA Regulates G9a Expression Accompanied by H3K9me2 and DNA Methylation in Early Differentiation from ESCs

ESCs 細(xì)胞型主要由復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，其中 Oct3/4 和 nanog 是調(diào)控型的核心因子，它們的表達(dá)變化都會(huì)引起細(xì)胞分化。在隨后的研究中發(fā)現(xiàn)在 Oct3/4 和 nanog 的啟動(dòng)子區(qū)域 H3K9 的二甲基化比例有所提高，同時(shí) Oct3/4 和 nanog 的啟動(dòng)子區(qū)域 DNA 甲基化程度也顯著提高。

為進(jìn)一步確定 PKA 在細(xì)胞早期分化的調(diào)控作用是由 G9a 所介導(dǎo)，建立了 CA-PKA(Dox-)-G9a-ckO（OHT+）細(xì)胞模型（Fig4A-B）。研究結(jié)果表明，當(dāng) G9a 表達(dá)被抑制后，在 PKA 激活狀態(tài)下優(yōu)勢(shì)表達(dá)的陽(yáng)性分化細(xì)胞及相關(guān)基因啟動(dòng)區(qū)的遺傳修飾均被消除（Fig4C-M）。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn) G9a 敲除小鼠胚胎也有類似表達(dá)，即更加充分證明了 PKA 和 G9a 共同調(diào)控胚胎（干細(xì)胞）的早期分化。



Fig 4. Effects of PKA on Early Differentiation Are Dependent on G9a



本研究為我們展示了基于 PKA 和 G9a 共同調(diào)控胚胎干細(xì)胞分化速度的分子機(jī)制（Fig5），有助于我們了解胚胎干細(xì)胞（ESC）維持自我更新及多向分化潛能的具體機(jī)制，有助于未來更好地將其應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。


Fig 5. Molecular Linkages Regulating Differentiation Timing in Early ESC Differentiation and Embryogenesis