[操作步驟] 1、 加樣：分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔、空白孔。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔7孔，依次加入100μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(見試劑準(zhǔn)備2)?？瞻卓准?00μL(見試劑準(zhǔn)備第二步后一管)，余孔加待測樣品100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC溫育2小時。

2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。

3、 每孔加檢測溶液A工作液100μL(臨用前配制)，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC溫育1小時。

4、 棄去孔內(nèi)液體，每孔用350μL的洗滌液洗滌，浸泡1-2分鐘，吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次(也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干)，重復(fù)洗板3次。后一次洗滌后，要把孔內(nèi)的洗滌液*甩干。自動洗板機亦可。

5、 每孔加檢測溶液B工作液(臨用前配制)100μL，加上覆膜，37oC溫育30分鐘。

6、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟4。

7、 每孔加底物溶液90μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37oC避光顯色(反應(yīng)時間控制在15-25分鐘，不要超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止)。

8、 每孔加終止溶液50μL，終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。如出現(xiàn)顏色不勻一，請輕輕晃動酶標(biāo)板以使溶液混合均勻。

9、 在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450nm波長測量各孔的光密度(O.D.值)。