實(shí)驗(yàn)方法原理    
實(shí)驗(yàn)材料    待標(biāo)記的培養(yǎng)細(xì)胞
試劑、試劑盒    37℃標(biāo)記培養(yǎng)液1 Ci／ml H3(32)PO4(溶于 HCl)冰冷 Tris 平衡鹽水(TBS) ／磷酸鹽平衡鹽水(PBS)溫和裂解緩沖液／RIPA 裂解緩沖液
儀器、耗材    樹脂玻璃擋板(1 in 厚)取液器吸頭樹脂玻璃盒37℃微量離心管一次性吸管 橡皮細(xì)胞刮子Sorvall 冷凍離心機(jī)(或其他)樹脂玻璃薄板／4℃ 樹脂玻璃管架
實(shí)驗(yàn)步驟    
實(shí)驗(yàn)試劑儀器的具體要求見「其他」。

1. 培養(yǎng)待標(biāo)記的細(xì)胞至適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)期。
生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞中磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到高峰，除非研究靜止期細(xì)胞的蛋白質(zhì)磷酸化，一般待標(biāo)記的細(xì)胞生長(zhǎng)密度不要達(dá)到匯片，標(biāo)記前 3～18 h 換新鮮的培養(yǎng)液培養(yǎng)將有利于標(biāo)記。

2. 吸去培養(yǎng)液，用 37℃ 的含血清不加標(biāo)記物的標(biāo)記培養(yǎng)液洗盡殘存的含磷酸鹽的培養(yǎng)液，吸盡該培養(yǎng)液。

3. 加入預(yù)熱的標(biāo)記培養(yǎng)液，加入量為：（0.5～1 ml）/35 mm 培養(yǎng)皿，（1～2 ml）/50 mm 培養(yǎng)皿，或（2～4 ml）/100 mm 培養(yǎng)皿。

4. 在樹脂玻璃擋板后操作，使用配備塞有棉花防浮質(zhì)吸管的微量移液器加入 32P 至終濃度為 0.1～2 mCi/ml。
標(biāo)記 1～2 h 已足夠，但細(xì)胞可在 6 h 內(nèi)耐受高達(dá) 2 mCi/ml 和在 18 h 內(nèi)耐受低濃度（0.1～0.5 mCi/ml）的輻射。

5. 將培養(yǎng)皿置于預(yù)熱的樹脂玻璃盒中，并將盒子置于培養(yǎng)箱中。

6. 標(biāo)記結(jié)束時(shí)，將裝有標(biāo)記細(xì)胞的樹脂玻璃盒移至冷室，放在樹脂玻璃擋板后面。

7. 從樹脂玻璃盒子中取出培養(yǎng)皿，用一次性的移液管吸盡標(biāo)記培養(yǎng)液，培養(yǎng)液和吸頭或吸管均作為同位素廢物棄置。

8. 用 2～10 ml 冷 TBS 洗滌細(xì)胞 2 次，同步驟 7 一樣吸盡并棄去放射性廢物。

9. 加適量裂解緩沖液（0.3 ml/35 mm 培養(yǎng)皿，0.6 ml/50 mm 培養(yǎng)皿或 1.0 ml/ 100 mm 培養(yǎng)皿），用橡皮細(xì)胞刮子擦刮下貼壁細(xì)胞，裂解物留在培養(yǎng)皿上，4℃ 放置 20 min。用橡皮細(xì)胞刮子將貼壁細(xì)胞的裂解液移至培養(yǎng)皿邊緣，并將裂解液移入帶螺口蓋的微量離心管中。

10. 蓋上管蓋，于 4℃ 26000 g 離心 30 min 澄清裂解液。

11. 離心后，將上清（裂解物）移至新離心管中，離心管和沉淀作為同位素污物處理。

12. 用凝膠電泳、免疫沉淀或蛋白質(zhì)純化方法，分析標(biāo)記的裂解液，所有過程均在4℃ 適當(dāng)屏蔽下進(jìn)行。
收起 
注意事項(xiàng)    
1. 除非特別說明，細(xì)胞培養(yǎng)在加濕的 37℃，10% CO2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

2. 步驟 7 中，不能用真空泵吸標(biāo)記培養(yǎng)液。真空泵抽吸會(huì)產(chǎn)生放射性氣溶膠并在儀器中留下放射性薄層。繼續(xù) Plexiglas 擋板后處理細(xì)胞和裂解。

3. 步驟 9 中，如果需要降低由非特異性雜質(zhì)造成非特異性的背景，可使用 RIPA 裂解緩沖液。如果要求保持酶 的活性或蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，使用含 CHAPS （3-膽酰胺丙基-二乙胺丙磺酚）或 Nonidet P-40 （乙基苯基聚二乙醇，即 NP-40）作為去污劑的溫和裂解緩沖液。要*溶解細(xì)胞和使蛋白質(zhì)變性，使用SDS裂解方法。

4. 步驟 10 中管內(nèi)液體是裝至半滿以防液體濺出。
用 RIPA 緩沖液制備裂解液時(shí)，由于細(xì)胞核的溶解常導(dǎo)致細(xì)胞裂解液變得黏稠。當(dāng)發(fā)生這種情況 時(shí)，延長(zhǎng)離心時(shí)間到 90 min，或離心前在 RIPA 液中加入 50 μl 固相化金黃色葡萄球菌，都可使 DNA 沉于管底。
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其他    
試劑：
標(biāo)記培養(yǎng)液：不含磷酸鹽的細(xì)胞培養(yǎng)液 （如 DMEM），添加了常規(guī)濃度的血清或用無磷酸鹽的鹽水透析過的血清，37℃
溶于 HCl 中的 1 Ci/ml H332PO4 （無載體，ICN）
Tris 平衡鹽水（TBS） 或磷酸鹽平衡鹽水（PBS），冰冷
溫和裂解緩沖液或 RIPA 裂解緩沖液

儀器：
1 in 厚的樹脂玻璃擋板
塞有濾芯的防浮質(zhì)的取液器吸頭
樹脂玻璃盒，預(yù)熱到 37℃
帶螺口蓋的微量離心管
一次性的吸管（塞有棉花）
橡皮細(xì)胞刮子
Sorvall 冷凍離心機(jī)，帶 SM 24 轉(zhuǎn)子和橡皮套管，或其他相當(dāng)?shù)睦鋬鲭x心機(jī)，4℃
樹脂玻璃薄板 （10 in × 10 in × 1/4 in） 或樹脂玻璃管架，4℃