實驗方法原理由于神經(jīng)干細胞(Neural Stem Cell)具有自我更新和多向分化的潛能，因此，可以采用懸浮神經(jīng)球培養(yǎng)的方法來獲得和研究。即將胚胎腦組織處理成單個細胞后，只有具有自我更新能力的細胞才能在培養(yǎng)液中克隆增殖成為懸浮的神經(jīng)球，并隨著傳代的進行，保持增殖能力和向多種神經(jīng)子代細胞分化的能力。

實驗材料新生SD大鼠

試劑、試劑盒多聚甲醛蒸餾水PBSDAB血清培養(yǎng)基多聚賴氨酸胎牛血清雙蒸水

儀器、耗材解剖顯微鏡眼科剪吸管24孔培養(yǎng)板制冰機勻漿器

實驗步驟

1.獲得特定腦組織。

2.獲取單細胞懸液通常有兩種方法。機械分離法操作步驟：

①用少量DF12液體覆蓋組織，再用虹膜剪剪碎組織塊成 1 mm3大??；

②將組織塊收集入神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液中；

③用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細胞懸液；

④細胞懸液過200目篩網(wǎng)；

⑤離心800r/min,3min,棄上清。

胰酶消化＋胰酶抑制劑終止法操作步驟：

②用虹膜剪剪碎組織塊成1mm3大??；

②用0.125%胰酶+0.02%EDTA消化組織，37℃-2min;

③加入胰酶抑制劑終止消化（使用濃度因生產(chǎn)公司不同、抑制劑活性不同而不同，可參考具體說明書）；

④800r/min離心3min,棄上清。

3.用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液重懸，用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細胞懸液，細胞計數(shù)，接種，密度為1x105/ml。

4.培養(yǎng)3-4d可以1/2量換液，培養(yǎng)7-10d進行傳代。程序：切收集神經(jīng)球入離心管，800r/min離心3min;

(2)棄上清，加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化組織，37℃孵育3-Smin;

＠加入等體積的1X胰酶抑制劑終止消化；

＠收集細胞入離心管中，800r/min離心3min,棄上清；

＠加入新的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液重懸，用fire-polished巴氏吸管吹吸成單細胞懸液，細胞計數(shù)，接種。

5.培養(yǎng)的神經(jīng)球可以接種于多聚賴氨酸包被的皿底或玻片上，加入神經(jīng)干細胞分化液分化誘導(dǎo)，使其向子代細胞分化。由于神經(jīng)千細胞懸浮培養(yǎng)的方法實際上是回顧性的判斷細胞的身份，即只有能夠持續(xù)傳代增殖并向多種方向分化的細胞才是真正的神經(jīng)于細胞，因此，結(jié)果的判讀就要結(jié)合多種方法綜合判斷。進行實驗的時候也需要通過對照的設(shè)置來保證實驗的可信度。具體方法如下：

1.形狀：

如圖1-8,神經(jīng)干細胞克隆增殖所獲得的球體一般形狀圓滑，質(zhì)地緊密，細胞聚集體一般松散而不規(guī)則。

2．免疫.細胞化學(xué)染色：

如圖I-9,Nestin是神經(jīng)干細胞的標(biāo)志物，可以通過Nestin免疫熒光染色來進行鑒定。:

3.自我更新能力：

嚴格的神經(jīng)于細胞實驗可以通過3-5次傳代來獲得純度較高的NSC。

4.分化潛能：神經(jīng)球分化后可以用神經(jīng)元標(biāo)記物、星形膠質(zhì)細胞標(biāo)記物(GFAP)、少突膠質(zhì)細胞標(biāo)記物(PDGFR)等來進行子代細胞的免疫熒光染色，判斷所得到的細胞是否具有多向分化潛能。

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注意事項

1.要注意區(qū)分細胞聚集體和克隆球體，可以根據(jù)上述結(jié)果判讀方法進行。

2細胞增殖能力與組織來源動物的年齡以及所取腦區(qū)都有很重要的關(guān)系。胎齡越小干細胞所處發(fā)育狀態(tài)越幼稚，細胞的增殖能力越強；皮層來源的神經(jīng)干細胞相比其他腦區(qū)更容易獲得增殖能力較好的細胞。

3.腦膜組織對于神經(jīng)干細胞有誘導(dǎo)貼壁和分化的作用，所以，組織處理過程中一定要清除干凈腦膜組織等。

4血清對千神經(jīng)干細胞有誘導(dǎo)分化的作用，所以終止消化時不能使用加有血清的培養(yǎng)液。

5傳代的時間一般為7-10d左右，但是如果神經(jīng)球的體積較大，光鏡下觀察其中心已經(jīng)開始出現(xiàn)黑色區(qū)域（產(chǎn)生黑色區(qū)域的原因可能是因為球體體積過大，影響光線透過，但是此時球體中心也往往會出現(xiàn)死細胞），則要及時傳代。

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其他

1.機械法分離獲得的細胞容易有細胞聚集，培養(yǎng)得來的球體就有可能不是單細胞克隆體；而消化法的消化液濃度和時間則要根據(jù)組織來源動物的不同年齡以及組織來源的不同區(qū)域進行調(diào)整，摸索消化濃度和時間。

2.由于神經(jīng)干細胞貼壁后也具有一定的促使分化的作用，所以，培養(yǎng)神經(jīng)干細胞的皿或瓶用新的無劃痕的器皿。

3如果觀察到培養(yǎng)過程中出現(xiàn)貼壁細胞，可以通過更換培養(yǎng)瓶的方法來進行挽救，并且發(fā)現(xiàn)后越早更換越好。但是如果球體還沒有形成，則盡量不要更換器皿和觸碰細胞，否則會影響神經(jīng)球的形成。