聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)可用于：（1）癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測；（2）遺傳病的致病基因分析；（3）基因診斷，基因制圖等領(lǐng)域。
實(shí)驗(yàn)方法原理    PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動速率，相同長度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動速率的不同，產(chǎn)生不同的泳動帶。PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動帶的變位即可推測存在堿基置換。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過DNA測序才能確定。因此PCR-SSCP檢測是測序之前突變篩查的常用手段。
實(shí)驗(yàn)材料    樣本DNA
試劑、試劑盒    Taq DNA聚合酶PCR反應(yīng)緩沖液引物dNTPs丙烯酰胺TBE緩沖液過硫酸銨TEMED甲酰胺上樣緩沖液固定液銀染液顯色液
儀器、耗材    電泳儀水浴鍋電泳槽
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、PCR反應(yīng)
20 ml反應(yīng)體系成分如下：
模板DNA（100 ng/ml）         1 ml
10×PCR反應(yīng)緩沖液                2 ml
Taq DNA聚合酶（5 U/ml）  0.2 ml
4×dNTPs（2.5 mmol/L）        1 ml
MTHFR上下游引物             各 1 ml
ddH2O 加至終體積               20 ml

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：
95℃ 5 min；
94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30個循環(huán)；
72℃ 7 min。
反應(yīng)結(jié)束后，置4℃保存。

二、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

1. 制備6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠：30%聚丙烯酰胺（交聯(lián)度49:1）10 ml，5×TBE緩沖液10 ml，加蒸餾水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%過硫酸銨250 ml，混勻后灌膠，插入加樣梳子。待膠*聚合后，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置，加入電泳緩沖液（1×TBE），緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔。

2. 取5 ml 擴(kuò)增產(chǎn)物加10 ml變性上樣緩沖液混勻，98℃變性10 min，迅速冰浴。

3. 取5 ml混合液加到點(diǎn)樣孔中，以1——8 V/cm電泳4——5 h。

三、聚丙烯酰胺凝膠染色

1. 拆下電泳裝置，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個塑料盤內(nèi)，用蒸餾水沖洗1——2遍。

2. 倒入固定液，固定8——10 min。

3. 用蒸餾水沖洗1——2遍；倒入銀染液，銀染10——12 min。

4. 用蒸餾水沖洗若干遍；倒入顯色液，顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶。

5. 用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠，觀察PCR-SSCP結(jié)果。

四、結(jié)果判斷

觀察并記錄聚丙烯酰胺凝膠上的DNA單鏈帶，根據(jù)異常泳動變位篩查突變樣本。

收起 
注意事項(xiàng)    
1. 靶DNA序列長度不宜過長，否則靈敏度下降。

2. DNA樣品在電場中泳動的長度一般要求在16——18 cm以上。

3. 染色在塑料盤中進(jìn)行。

4. 環(huán)境溫度越高，聚丙烯酰胺凝膠越易凝固。應(yīng)根據(jù)環(huán)境溫度的變化調(diào)整

凝膠中10％過硫酸銨與TEMED的用量。

5. 電泳過程中應(yīng)保持恒溫，使用薄的凝膠和冷卻系統(tǒng)以散發(fā)熱量。

6. 用AgNO3染色時，染色時間需隨環(huán)境溫度變化作適當(dāng)調(diào)整，環(huán)境溫度越

低，所需的染色時間越長。

7. 顯色時間不可過長，以免背景過深影響結(jié)果觀察。