實驗方法原理    通過特異性阻斷PI3K和mTOR，觀察HepG2和Hep3B細胞株PI3K/Akt/mTOR信號通路活性及生物學行為的改變，探討相關的分子機制。

實驗材料    HepG2人肝癌細胞Hep3B人肝癌細胞株人正常肝細胞株QSG-7701
試劑、試劑盒    LY294002Rapamycin阿霉素
儀器、耗材    流式細胞儀熒光顯微鏡二氧化碳細胞培養(yǎng)箱酶標儀培養(yǎng)板蓋玻片載玻片
實驗步驟    
一、細胞株表達情況監(jiān)測

1.  在培養(yǎng)的HepG2、Hep3B人肝癌細胞株和人正常肝細胞株QSG-7701上，以免疫印跡方法（Western blot）檢測各細胞株中PI3K（p110α亞單位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表達情況。

2.  分別用 PI3K抑制劑LY294002（50 umol/ml）和mTOR抑制劑Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B細胞，以MTT比色法檢測細胞的增殖能力，以流式細胞術（Flow cytometry）檢測細胞周期和凋亡情況，以Western blot法檢測細胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表達改變。
 
二、細胞株表達結果

1.  PTEN在HepG2和Hep3B細胞中基本無表達，在QSG-7701細胞株中高表達，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B細胞中的 表達較QSG-7701細胞均顯著升高。

2.  LY294002和RAPA均呈劑量-時間依賴的抑制HepG2和Hep3B細胞生長。飽和效應濃度的 LY294002和RAPA作用24小時后，HepG2和Hep3B細胞均呈現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，處于S期的細胞比例較對照組顯著減少 （P<0.01）。

3.  兩給藥組中HepG2細胞和Hep3B細胞的凋亡率與對照組比較均顯著增加（P<0.01）。

4.  兩給藥組HepG2細胞的凋 亡率顯著高于Hep3B細胞（P<0.01或P<0.05），并且HepG2細胞的凋亡率在RAPA給藥組顯著高于LY294002給藥組 （P<0.01），但Hep3B細胞的凋亡率在兩組間無顯著差異。

5.  飽和效應濃度的LY294002作用48小時后，HepG2和Hep3B細胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表達水平較對照組均顯著降低（P<0.01），飽和效應濃度的RAPA作用48小時后，HepG2和Hep3B細胞中P-mTOR（S2448）的表達水平較對照組均顯著降低（P<0.01），而pAkt（T308，S473）的 表達水平較對照組均顯著升高（分別P<0.01）。
 
三、結果分析

1.  HepG2和Hep3B細胞存在PI3K/Akt/mTOR信號通路的組成性激活。

2.  LY294002和RAPA能有效阻斷HepG2和 Hep3B細胞PI3K/Akt/mTOR信號通路，抑制HCC細胞的生長增殖，誘導細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，且阻斷效應與HCC細胞P53的表達有 關。

3.  一定濃度范圍內(nèi)，HepG2細胞對PI3K/Akt/mTOR信號通路阻斷劑的敏感性高于Hep3B細胞，RAPA對PI3K/Akt /mTOR信號通路的部分阻斷效應優(yōu)于LY294002。
 
 
 
 
收起 
其他    
一、PI3K簡介

PI3K是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導分子，根據(jù)PI3K的P110亞基結構特點和底物分子不同可將其分為三大類，其中第Ⅰ類 PI3K 功能為重要，下面所述 PI3K 指的都是第Ⅰ類 PI3K。

PI3K主要由催化亞基 P110 和調(diào)節(jié)亞基 P85 組成。PI3K 可被生長因子、細胞因子、激素等細胞外信號刺激激活。PI3K激活可使膜磷酸肌醇磷酸化，催化肌醇環(huán)上3位羥基生成3,4 二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol-3,4-biphosphate，PI-3,4P2)及 3,4,5 三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PI-3,4,5P3)，它們均可作為第二信使在細胞中傳遞信號，介導 PI3K 的多種細胞功能，如這些脂質(zhì)產(chǎn)物可通過與 Akt 的 PH(pleckstrin homology)區(qū)結合來激活Akt。腫瘤抑制基因pten(phosphatase and tensinhomologdelet-edonchromosometen)表達產(chǎn)物可誘導3磷酸肌醇去磷酸化，從而可對 PI3K 途徑進行負調(diào)節(jié)。

二、Akt簡介
 
Akt是一種Ser/Thr蛋白激酶。在磷脂酰肌醇依賴的蛋白激酶(phosphoinositide-dependent protein kinase，PDK)的協(xié)同作用下，PI-3,4P2 和 PI-3,4,5P3 可與Akt結合，導致Akt從胞漿轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜，并促進 Akt 的 Ser473 和 Thr308 位點磷酸化。

Ser473或/和Thr308 位點的磷酸化是Akt激活的必要條件，而Akt激活是其發(fā)揮促細胞生存功能的重要前提。激活的 Akt 主要通過促進 Bad(Bcl-2 家族促凋亡成員之一)、mTOR、Caspase 3、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3,  GSK-3)等下游底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學效應，包括抗凋亡、促細胞生存等功能。

三、mTOR簡介

mTOR也被稱為FRAP(FKBP-rapamycin-associated protein)，屬于磷酸肌醇激酶3相關激酶(PIKKs)家族的一員，是PI3K/Akt的下游底物，可通過改變翻譯調(diào)節(jié)因子4E-BP1(真核細胞啟動因子4E結合蛋白)和 p70S6k的磷酸化狀態(tài)啟動翻譯過程。

去磷酸化狀態(tài)的4E-BP1能與翻譯起始因子eIF-4E結合，從而使后者喪失活性，而磷酸化的4E-BP1可解離釋放eIF-4E，從而使后者結合于 mRNA 5'端起始點啟動翻譯過程。p70S6k磷酸化可通過促使40S核糖體蛋白S6磷酸化而啟動翻譯。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在正常和腫瘤細胞的增殖和生存中具有重要作用，以抑制mTOR為主要作用原理的抗腫瘤藥物已經(jīng)進入臨床開發(fā)的早期階段。