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輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書

來源:青島捷世康生物科技有限公司   2019年04月01日 16:07  

 

輔酶NADP(H)含量試劑盒說明書

 

微量法 100 /48 

 

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義

 

輔酶NADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,NADP+ NADPH 含量測定可以計(jì)算 NADPNADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一,而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

 

測定原理

 

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+ NADPH。NADPH 通過 PMS 的遞氫作用,使氧化型噻唑藍(lán)(MTT)還原為甲瓚,570nm 下檢測吸光值,從而測定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原 NADP+ NADPH,從而檢測 NADP+含量。

所需的儀器和用品

 

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

試劑的組成和配制

 

酸性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

 

堿性提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑一:液體 10 mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑二:粉劑×1 支,-20 ℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻;溶解后 4 ℃保存一周;

 

試劑三:粉劑×1 支,-20℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻;溶解后 4℃保存一周;

 

試劑四:粉劑×1 支,℃保存,用時(shí)加入 3mL 蒸餾水,混勻;溶解后 4℃保存一周;

 

試劑五:液體 3.6mL×1 支,℃保存;

 

試劑六:液體 30mL×1 瓶,℃保存;

 

試劑七:液體 50mL×1 瓶,℃保存。

 

NADP+ NADPH 的提取

血清(漿)中 NADP+ NADPH 的提取

 

NADP+的提取:按照血清(漿)體積(mL):酸性提取液體積(mL)為 15~10 的比例(建議取約 0.1mL 血清(漿),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

NADPH 的提取:按照血清(漿)體積(mL):堿性提取液體積(mL)為 15~10 的比例(建議取約 0.1mL 血清(漿),加入 1mL 堿性提取液),95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

組織中 NADP+ NADPH 的提取

 

NADP+的提取:按照組織質(zhì)量(g):酸性提取液體積(mL)為 15~10 的比例(建議取約 0.1g 組織,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

NADPH 的提取:按照組織質(zhì)量(g):堿性提取液體積(mL)為 15~10 的比例(建議取約

 

0.1g 組織,加入 1mL 堿性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP+ NADPH 的提取

 

NADP+的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):酸性提取液體積(mL)為 500~1000的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min (蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加

 

入 500μL 堿性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。 NADPH 的提取:先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi),棄上清,按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):堿性提取液體積(mL)為 500~1000的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液),超聲波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次),95℃水浴 5min (蓋緊,以防止水分散失);冰浴中冷卻后,10000g 4 ℃離心 10min;取 500μL 上清液,加

 

入 500μL 酸性提取液使之中和,混勻,10000g 4 ℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

測定步驟

 

1 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 570nm,蒸餾水調(diào)零。

 

2、 加樣表( 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣):

 

試劑名稱(μL)

 

對照管

 

測定管

樣本

20

20

試劑一

80

80

試劑二

30

30

試劑三

30

30

試劑四

30

30

試劑五

30

30

試劑六

200

 

混勻,室溫避光靜置 20min

試劑六

  

200

充分混勻,靜置 5min 后,20000g,25℃離心 5min,棄上清,沉淀中加入:

試劑七

 

400

 

400

 

混勻,取 200μ轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中,570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值 A2,計(jì)算A=A2-A1。

 

注意事項(xiàng)

 

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多,可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

 

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別:對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六;測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

 

3、反應(yīng)過程中注意避光。

 

4、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管,本試劑盒 100 管保證測 48 個(gè) NADP+ NADPH.

 

NADP+ NADPH 含量的計(jì)算

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

 

(一)NADP+含量的計(jì)算

1、血清(漿)中 NADP+含量計(jì)算

NADP+含量(nmol/mL=[4.57× (A -0.062×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 91.4×(A -0.062

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP+含量計(jì)算

 

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADP+ (nmol/mg prot=[ 4.57×(A -0.062×V1) ]÷(V1×Cpr)= 4.57×(A -0.062÷Cpr

 

(2)按樣本鮮重計(jì)算

 

NADP+ (nmol/g 鮮重)= [ 4.57×(A -0.062×V1) ]÷(W×V1÷V2)=9.14×(A -0.062÷W

 

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

NADP+ (nmol/104 cell=[ 4.57×(A -0.062×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0183×(A -0.062

 

(二)NADPH 含量的計(jì)算

 

1、血清(漿)中 NADPH 含量計(jì)算

 

NADPH 含量(nmol/mL=[7.2× (A -0.072×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 144× (A -0.072

 

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADPH 含量計(jì)算

 

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

 

NADPH (nmol/mg prot= [7.2× (A -0.072×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.2× (A -0.072÷Cpr

 

(2)按樣本鮮重計(jì)算

 

NADPH (nmol/g 鮮重)= [7.2× (A -0.072×V1) ]÷(W×V1÷V2)=14.4× (A -0.072÷W

 

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

NADPH (nmol/104 cell= [7.2× (A -0.072×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0288× (A -0.072V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mL;V3:加入血清(漿)體積:0.1mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),

 

500 萬。

 

b. 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

 

(一)NADP+含量的計(jì)算

1、血清(漿)中 NADP+含量計(jì)算

NADP+含量(nmol/mL=[9.14× (A -0.062×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 182.8×(A -0.062

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP+含量計(jì)算

 

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

 

NADP+ (nmol/mg prot=[ 9.14×(A -0.062×V1) ]÷(V1×Cpr)= 9.14×(A -0.062÷Cpr

 

(2)按樣本鮮重計(jì)算

 

NADP+ (nmol/g 鮮重)= [ 9.14×(A -0.062×V1) ]÷(W×V1÷V2)=18.28×(A -0.062÷W

 

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

NADP+ (nmol/104 cell=[ 9.14×(A -0.062×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0366×(A -0.062

 

(二)NADPH 含量的計(jì)算

 

1、血清(漿)中 NADPH 含量計(jì)算

 

NADPH 含量(nmol/mL=[14.4× (A -0.072×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 288× (A -0.072

 

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADPH 含量計(jì)算

 

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

 

NADPH (nmol/mg prot= [14.4× (A -0.072×V1) ]÷(V1×Cpr)= 14.4× (A -0.072÷Cpr

 

(2)按樣本鮮重計(jì)算

 

NADPH (nmol/g 鮮重)= [14.4× (A -0.072×V1) ]÷(W×V1÷V2)=28.8× (A -0.072÷W

 

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

 

NADPH (nmol/104 cell= [14.4× (A -0.072×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0576× (A -0.072V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.02mL;V2:加入提取液體積,2mLV3:加入血清(漿)體積:0.1mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL; W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),

 

500 萬。

 

注意:低檢測限為 1nmol/mL  1nmol/g 鮮重  0.01nmol/mg prot


 

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