輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒說明書

微量法 100 管/48 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP⁺和 NADPH 含量測定可以計(jì)算 NADP（NADPH + NADP⁺ )含量和 NADPH/NADP⁺比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP⁺比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測定原理

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP⁺和 NADPH。NADPH 通過 PMS 的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm 下檢測吸光值，從而測定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原 NADP⁺為 NADPH，從而檢測 NADP⁺含量。

所需的儀器和用品

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

酸性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

堿性提取液：液體 50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 10 mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 支，-20 ℃保存，用時(shí)加入 3mL 蒸餾水，混勻；溶解后 4 ℃保存一周；

試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存，用時(shí)加入 3mL 蒸餾水，混勻；溶解后 4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1 支，4 ℃保存，用時(shí)加入 3mL 蒸餾水，混勻；溶解后 4℃保存一周；

試劑五：液體 3.6mL×1 支，4 ℃保存；

試劑六：液體 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NADP⁺和 NADPH 的提取

1 血清（漿）中 NADP⁺和 NADPH 的提取

NADP⁺的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提取：按照血清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL 血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2 組織中 NADP⁺和 NADPH 的提取：

NADP⁺的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約

0.1g 組織，加入 1mL 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP⁺和 NADPH 的提取：

NADP⁺的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min （蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加

入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 NADPH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min （蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加

入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 加樣表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：

混勻，取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值 A2，計(jì)算△A=A2-A1。

注意事項(xiàng)

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、由于每一個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管，本試劑盒 100 管保證測 48 個(gè) NADP⁺或 NADPH.

NADP⁺和 NADPH 含量的計(jì)算

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

（一）NADP⁺含量的計(jì)算

1、血清（漿）中 NADP⁺含量計(jì)算

NADP⁺含量(nmol/mL）=[4.57× (△A -0.062）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 91.4×(△A -0.062）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP⁺含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[ 4.57×(△A -0.062）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 4.57×(△A -0.062）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADP⁺ (nmol/g 鮮重）= [ 4.57×(△A -0.062）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=9.14×(△A -0.062）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[ 4.57×(△A -0.062）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0183×(△A -0.062）

（二）NADPH 含量的計(jì)算

1、血清（漿）中 NADPH 含量計(jì)算

NADPH 含量(nmol/mL）=[7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 144× (△A -0.072）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADPH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADPH (nmol/mg prot）= [7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.2× (△A -0.072）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADPH (nmol/g 鮮重）= [7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=14.4× (△A -0.072）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADPH (nmol/10⁴ cell）= [7.2× (△A -0.072）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0288× (△A -0.072）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，

500 萬。

b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

（一）NADP⁺含量的計(jì)算

1、血清（漿）中 NADP⁺含量計(jì)算

NADP⁺含量(nmol/mL）=[9.14× (△A -0.062）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 182.8×(△A -0.062）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP⁺含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADP⁺ (nmol/mg prot）=[ 9.14×(△A -0.062）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 9.14×(△A -0.062）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADP⁺ (nmol/g 鮮重）= [ 9.14×(△A -0.062）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=18.28×(△A -0.062）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADP⁺ (nmol/10⁴ cell）=[ 9.14×(△A -0.062）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0366×(△A -0.062）

（二）NADPH 含量的計(jì)算

1、血清（漿）中 NADPH 含量計(jì)算

NADPH 含量(nmol/mL）=[14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 288× (△A -0.072）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADPH 含量計(jì)算

(1)按樣本蛋白濃度計(jì)算

NADPH (nmol/mg prot）= [14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(V1×Cpr)= 14.4× (△A -0.072）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算

NADPH (nmol/g 鮮重）= [14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(W×V1÷V2)=28.8× (△A -0.072）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

NADPH (nmol/10⁴ cell）= [14.4× (△A -0.072）×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0576× (△A -0.072）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，

500 萬。

注意：低檢測限為 1nmol/mL 或 1nmol/g 鮮重 或 0.01nmol/mg prot