人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-C)|通過(guò)STR鑒定

細(xì)胞名稱：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-C)

培養(yǎng)條件：Sciencecell ECM+10%特級(jí)胎牛血清（推薦S-FBS-AU-015）

細(xì)胞來(lái)源：ATCC細(xì)胞庫(kù)

代數(shù)：P3代細(xì)胞

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-C)|通過(guò)STR鑒定

一、傳代：

1.用75%酒精噴灑整個(gè)瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行1-3小時(shí)的緩沖，.然后置于無(wú)菌操作臺(tái)，打開(kāi)瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及培養(yǎng)基顏色變化對(duì)其進(jìn)行換液以及傳代；

2.待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底面積80%-90%，需要對(duì)其進(jìn)行傳代，次傳代比例為1:2；

3.傳代步驟：將0.25%含EDTA胰酶置于37°預(yù)熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入3-5 ml PBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1-2 ml預(yù)熱好的胰酶，置于37°孵育消化（次消化需時(shí)常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細(xì)胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見(jiàn)細(xì)胞脫落為好消化時(shí)間，記錄好消化時(shí)間，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細(xì)胞，使之*脫落，然后收集細(xì)胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行傳代。

二、保存：

凍存條件：80%*培養(yǎng)基+10%FBS+10%DMSO

(備注：建議使用本公司的冷凍液HAKATA（H-W-100），用4度保存的冷凍液直接重懸細(xì)胞，不能預(yù)熱后使用。)

保存條件：液氮存儲(chǔ)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC-C)|通過(guò)STR鑒定細(xì)胞在生存過(guò)程中經(jīng)歷以下三個(gè)階段：

　　1.原代培養(yǎng)期(primary culture)

　　組織到次傳代時(shí)間大約為1～4周

　　特點(diǎn)：

　　細(xì)胞活躍移動(dòng),分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。

　　原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)基本相似。

　　各細(xì)胞的遺傳性狀互不相關(guān)，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)，如果把這種稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)細(xì)胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細(xì)胞獨(dú)立生存性差。

　　2.傳代期(passage)

　　初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便稱之為細(xì)胞系(cell line)

　　特點(diǎn)：

　　細(xì)胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細(xì)胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代或傳代早期凍存為好。

　　一般細(xì)胞在10代以內(nèi)凍存。

　　凍存配方：

　　向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

　　存于在液氮中溫度可達(dá)到-196℃，可長(zhǎng)期儲(chǔ)存。如解凍后細(xì)胞復(fù)蘇，仍能繼續(xù)增殖生長(zhǎng)，細(xì)胞性狀不受影響，成為保存細(xì)胞主要的手段。

　　3.衰退期

　　特點(diǎn)：細(xì)胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強(qiáng) 衰退凋亡

　　注意：細(xì)胞在三期中的任何一期(一般發(fā)生在傳代后期或衰退期)在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(spontaneous transformation);

細(xì)胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性性(malignancy)。細(xì)胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱為連續(xù)細(xì)胞系(continuous cell line)。而細(xì)胞獲得不死性后,細(xì)胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

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培養(yǎng)過(guò)程中，可能遇到幾個(gè)問(wèn)題：

1、細(xì)胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點(diǎn)是污染嗎?如何處理?

一旦您在細(xì)胞培養(yǎng)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有黑點(diǎn)生成，首先，要肉眼觀察微生物培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的狀態(tài)，黑點(diǎn)是否游動(dòng)。如果細(xì)胞被污染，微生物則會(huì)大量繁殖，微生物培養(yǎng)基就會(huì)迅速變黃、變混濁。污染包括細(xì)菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細(xì)胞，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，與黑點(diǎn)出現(xiàn)前相比，沒(méi)有任何變化，那么，黑點(diǎn)的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關(guān)：

(1)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)老，破碎的細(xì)胞殘骸;

(2)血清質(zhì)量不好，反復(fù)凍融的結(jié)果;

(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細(xì)胞生長(zhǎng);

(4)培養(yǎng)原代細(xì)胞中出現(xiàn)小黑點(diǎn)，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。

2、EDTA在細(xì)胞消化過(guò)程中起什么作用?

EDTA是一種螯合劑，它可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而細(xì)胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結(jié)合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的，把這些離子螯合后，可以加速細(xì)胞和培養(yǎng)皿的脫離，促進(jìn)消化。上皮類細(xì)胞的連接存在“橋粒”結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞間“牢固”的連接，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細(xì)胞時(shí)，加入EDTA，可以破壞細(xì)胞的橋粒結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞能夠分散成單個(gè)細(xì)胞。通俗地說(shuō)，就是破壞細(xì)胞間的粘連。

3、如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。選擇DMEM做貼壁細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。另外還可以參考ATCC網(wǎng)站的推薦信息。

4、怎樣讓細(xì)胞適應(yīng)新的條件?

從原條件逐漸過(guò)度：1/4、1/2、3/4，后是*新培養(yǎng)基。

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