滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）試劑盒操作方法
滾環(huán)擴(kuò)增（rolling   circle   amplification，RCA）是近幾年發(fā)展起來的一種核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法。以環(huán)狀 DNA 為模板，通過一個短的 DNA 引物（與部分環(huán)狀模板互補(bǔ)），在 phi29 DNA 聚合酶催化下將 dNTPs 轉(zhuǎn)變成單鏈 DNA，此單鏈 DNA 包含成百上千個重復(fù)的模板互補(bǔ)片段。這種方法不僅可以直接擴(kuò)增 DNA 和 RNA，還可以實(shí)現(xiàn)對靶核酸的信號放大，靈敏度達(dá)到一個拷貝的核酸分子，因此在核酸檢測中具有很大的應(yīng)用價值和潛力。因其高靈敏度、高特異性和可操作性，RCA 技術(shù)在基礎(chǔ)研究、實(shí)際檢測、醫(yī)療診斷及納米材料等方面都有很好的應(yīng)用，結(jié)合細(xì)胞原位檢測、單核苷酸多態(tài)性 SNPs， 蛋白質(zhì)分析、免疫芯片和全基因組的擴(kuò)增等研究都能發(fā)揮其巨大的優(yōu)勢。

本試劑盒配備的 phi29 DNA 聚合酶具有鏈置換和連續(xù)合成特性，可連續(xù)合成長達(dá) 70kb 的 DNA 片段。另外，該酶具有 3’→5’外切酶校讀功能，合成的 DNA 片段保真性高。試劑盒配備的 Random Hexamers 為 6 堿基隨機(jī)引物可對目標(biāo)分子進(jìn)行指數(shù)放大（通常放大 10000 倍）。

滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）試劑盒操作方法RCA 的原理圖如下：

滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）試劑盒操作方法本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)：

即開即用，十分簡單方便，用戶不需要單獨(dú)準(zhǔn)備各成分。配方經(jīng)過精心優(yōu)化，長模板可以達(dá)  70kb。

高保真酶，所得 DNA 突變率低

本試劑盒可以進(jìn)行 50 次 20uL 體系的 RCA 實(shí)驗(yàn)。

1. 純化帶有靶片段的環(huán)狀 DNA 或長度在 10kb 以上的線狀 DNA，將其準(zhǔn)確定量并稀釋到 2pg/uL。注意：堿變性法提取的質(zhì)粒 DNA 都有殘留的 RNA 污染，盡管電泳時看不見，但測 OD 時這些 RNA 會使得 DNA 濃度虛高。因此質(zhì)粒 DNA 需要電泳時跟濃度已知的 DNA marker 比較來確定濃度。此方法誤差在 2 倍之內(nèi)，但可以接受。

2. 在 PCR 塑料管中加入不超過 5 uL 純化好的模板 DNA，用量在 50pg 左右。如果體積不足 5uL，則用自備的超純水補(bǔ)齊。同時做一個不加模板 DNA 模板的陰性對照。

3. 加入等體積（2.5uL）變性液，輕柔吹打混勻。

4. 室溫放置 2 分鐘。

5. 加入 2.5uL RCA 溶液 A。此時樣品總體積為 10uL。

6. 在 10uL 樣品中，加入 10 uL 的 RCA 溶液 B，輕柔吹打混合均勻。

7. 加入 1 uL phi 29 DNA 聚合酶（10U/uL），輕柔吹打混合均勻。

8. 30℃保溫 24 小時。注意：反應(yīng)時間不要短于 24 小時。使用 PCR 儀進(jìn)行 30℃ 保溫并打開熱蓋保溫。如果采用 30℃水浴，在樣品管中加入 30-50uL 石蠟油以防水分蒸發(fā)，因?yàn)?nbsp;30℃長時間的水浴也能使水分蒸發(fā)到管壁，從而改變反應(yīng)體系中各成分的濃度、降低 RCA 反應(yīng)效率。

9. 65℃保溫 10 分鐘使 phi29 DNA 聚合酶滅活。注：由于 phi29 DNA 聚合酶有 DNA

外切活性，所以將其滅活以免干擾后續(xù)反應(yīng)。

10. 立即取 5uL RCA 反應(yīng)液進(jìn)行電泳檢測擴(kuò)增效果，DNA 片段大小將在 10kb 以上， 可達(dá) 70kb。

11. 擴(kuò)增的 DNA 可以用于后續(xù)試驗(yàn)或電泳檢測。換一下
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